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蛋白质组学是对器官、组织或细胞内所有蛋白质进行大规模研究，其终极目标为全面理解并重构目标蛋白质组的构成、功能及生物过程。其中，差异蛋白质组学通过比较特定蛋白质组在不同状态下的差异来探究生理和病理机制，对于理解疾病发展、治疗方法开发和临床生物标志物的发现具有重要意义。蛋白质的功能不仅与具体蛋白质的表达水平和含量密切相关，还与蛋白质间的相互作用和具体结构形式直接相关。目前，差异蛋白质组学研究多采用shotgun(鸟枪法)分析策略，该策略在定性定量方面表现出极高的性能，但在完整蛋白质到肽段的处理过程中不可避免会造成大量蛋白质结构和相互作用的破坏且难以追溯，而这些信息对于全面理解蛋白质组的功能具有重要意义。基于此现状，本文建立了基于一维凝胶电泳-液相色谱-质谱(1DE-LC-MS)系统化分析的差异蛋白质组学研究策略，利用1DE对蛋白结构信息的保留和分离的高效性，及LC-MS/MS在大规模鉴定和定量上的高性能，实现对蛋白组学样品的大规模差异分析，同时获取与蛋白质相互作用及蛋白质降解等结构相关的信息。该策略主要由五步构成：1)非变性PAGE或SDS-PAGE分离样品；2)针对每个样品泳道平行切胶；3)对所有胶粒进行胶内酶解，接以定量LC-MS/MS分析；4)数据分析，得到蛋白质鉴定及定量结果，进行蛋白质含量差异分析；5)重构蛋白质在1DE凝胶泳道上的含量分布谱图(1DE-MS blots)，并进行与相互作用和亚基组成相关联的差异分析。本文分别在非变性1DE和SDS-PAGE情况下，将1DE-LC-MS系统化分析方法应用于人血浆/血清差异和不同时期脑缺血复灌损伤的研究中，在蛋白质含量差异分析的同时挖掘蛋白质结构信息。
本文具体的研究内容及结果如下：
1．1DE-LC-MS系统化分析方法中关键步骤的建立和优化。首先，通过自制的装置实现了批量梯度PAGE胶制备和平行电泳；其次，根据实际的凝胶尺寸设计平行切胶工具，将凝胶沿电泳方向切成大小均一的小胶粒，并将胶内酶解流程进行了标准化；然后，通过实验明确了凝胶电泳后CBB染色对于1DE-LC-MS系统化分析的有利作用；最后，建立“native1DE-MSblots”(非变性1DE情况)或“SDS-PAGE-MSblots”(SDS-PAGE情况)进行蛋白质结构信息挖掘。
2．结合非变性1DE、平行切胶和定量LC-MS/MS，本文建立了非变性1DE-LC-MS系统化分析方法，并应用于人血浆和血清的差异分析中。在不去除高丰度蛋白质的情况下，成功鉴定了315个蛋白质，其中33个在血浆/血清中的含量存在显著差异(变化倍数≥2或≤0.5，p≤0.05)。除含量差异外，通过比较蛋白质的native1DEMS-blots，我们还发现许多蛋白质在血浆/血清中结构也不同，这与凝血、补体激活中的多种酶促反应直接相关。
3．结合SDS-PAGE、平行切胶和定量LC-MS/MS，本文建立了SDS-PAGE-LC-MS系统化分析方法，并应用于不同时期脑缺血复灌损伤(I/R)大鼠脑皮质蛋白质组的差异研究。此研究设置了I/R模型组(缺血2小时+复灌1天、7天和14天)以及对应假手术对照组，共6个研究组(n=4)，大鼠脑皮质蛋白质经SDS-PAGE分离后，进行全泳道切胶接以定量LC-MS/MS分析。最终鉴定到5621个蛋白质，三个时间点的模型组与对应的假手术组相比较分别有568、755和492个蛋白质发生显著的含量变化(变化倍数≥1.5或≤0.67，p≤0.05)。生物信息学分析提示在缺血复灌损伤的不同时期最突出的改变集中在细胞骨架、突触可塑性、能量代谢、炎症反应和溶酶体五大方面。此外，通过分析蛋白质的SDS-PAGE-MSblots，我们发现许多蛋白质存在降解现象，对于理解缺血复灌损伤机理和治疗方法的开发具有重要意义。这是常规差异蛋白质组学方法无法获取的，表明本策略在大规模组学分析上的独特优势。
综上所述，本研究建立了基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略并开展了实际应用。常规的shotgun差异蛋白质策略只能获得蛋白质含量差异信息，相比之下我们建立的1DE-LC-MS系统化分析方法不仅可以分析蛋白质的含量差异还能根据1DE-MSblots追溯相关结构信息，如亚基组成、切割或降解、或相互作用等，为全面理解蛋白质的功能及生理病理机制提供更丰富的信息。
本文具体的研究内容及结果如下：
1．1DE-LC-MS系统化分析方法中关键步骤的建立和优化。首先，通过自制的装置实现了批量梯度PAGE胶制备和平行电泳；其次，根据实际的凝胶尺寸设计平行切胶工具，将凝胶沿电泳方向切成大小均一的小胶粒，并将胶内酶解流程进行了标准化；然后，通过实验明确了凝胶电泳后CBB染色对于1DE-LC-MS系统化分析的有利作用；最后，建立“native1DE-MSblots”(非变性1DE情况)或“SDS-PAGE-MSblots”(SDS-PAGE情况)进行蛋白质结构信息挖掘。
2．结合非变性1DE、平行切胶和定量LC-MS/MS，本文建立了非变性1DE-LC-MS系统化分析方法，并应用于人血浆和血清的差异分析中。在不去除高丰度蛋白质的情况下，成功鉴定了315个蛋白质，其中33个在血浆/血清中的含量存在显著差异(变化倍数≥2或≤0.5，p≤0.05)。除含量差异外，通过比较蛋白质的native1DEMS-blots，我们还发现许多蛋白质在血浆/血清中结构也不同，这与凝血、补体激活中的多种酶促反应直接相关。
3．结合SDS-PAGE、平行切胶和定量LC-MS/MS，本文建立了SDS-PAGE-LC-MS系统化分析方法，并应用于不同时期脑缺血复灌损伤(I/R)大鼠脑皮质蛋白质组的差异研究。此研究设置了I/R模型组(缺血2小时+复灌1天、7天和14天)以及对应假手术对照组，共6个研究组(n=4)，大鼠脑皮质蛋白质经SDS-PAGE分离后，进行全泳道切胶接以定量LC-MS/MS分析。最终鉴定到5621个蛋白质，三个时间点的模型组与对应的假手术组相比较分别有568、755和492个蛋白质发生显著的含量变化(变化倍数≥1.5或≤0.67，p≤0.05)。生物信息学分析提示在缺血复灌损伤的不同时期最突出的改变集中在细胞骨架、突触可塑性、能量代谢、炎症反应和溶酶体五大方面。此外，通过分析蛋白质的SDS-PAGE-MSblots，我们发现许多蛋白质存在降解现象，对于理解缺血复灌损伤机理和治疗方法的开发具有重要意义。这是常规差异蛋白质组学方法无法获取的，表明本策略在大规模组学分析上的独特优势。
综上所述，本研究建立了基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略并开展了实际应用。常规的shotgun差异蛋白质策略只能获得蛋白质含量差异信息，相比之下我们建立的1DE-LC-MS系统化分析方法不仅可以分析蛋白质的含量差异还能根据1DE-MSblots追溯相关结构信息，如亚基组成、切割或降解、或相互作用等，为全面理解蛋白质的功能及生理病理机制提供更丰富的信息。