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胶质母细胞瘤(多形性成胶质细胞瘤)，又称为四级星形细胞瘤，与其他的胶质瘤一起构成了绝大多数的恶性脑瘤。胶质母细胞瘤是恶性程度最高的脑肿瘤，具有高死亡率，预后差以及生存期短等特性。目前亟需探索更多胶质母细胞瘤的诊断和治疗方案来进一步延长胶质母细胞瘤病人的生存期。核仁纺锤体相关蛋白1(NUSAP1)最初是作为一个有丝分裂调控因子被发现，同时NUSAP1也是一个微管结合蛋白。NUSAP1不仅参与到有丝分裂过程中，在多种生物学进程尤其是肿瘤生物学中也发挥着必不可少的作用。研究表明，NUSAP1在多种人类肿瘤中高表达，因此NUSAP1是肿瘤治疗中的一个潜在靶标。然而，NUSAP1在胶质母细胞瘤中的作用尚不清楚。本论文旨在研究NUSAP1在胶质母细胞瘤中所扮演的角色。结合临床数据平台及临床样本的分析，NUSAP1可作为胶质母细胞瘤诊断及治疗的分子标记物。结合细胞水平及体内水平的研究，NUSAP1能够促进胶质母细胞瘤的生长，并且NUSAP1能够增强胶质母细胞瘤的化学耐药性，提供了NUSAP1在胶质母细胞瘤治疗中的理论基础。主要研究结果如下：
1.NUSAP1在胶质瘤中高表达并且其高表达与胶质瘤病人的不良预后密切相关。
为了研究NUSAP1在胶质母细胞瘤中扮演的角色，我们开展了免疫组化实验。通过对8例正常脑组织以及64例胶质瘤样本中NUSAP1的表达水平的检测发现NUSAP1在胶质瘤样本中高表达，并且与胶质瘤的分级呈正相关，随着胶质瘤级别的增加NUSAP1的表达水平明显升高。我们随后对4个胶质母细胞瘤细胞系A172、U-118MG、U-87MG和LN-229中NUSAP1的表达量进行了检测，发现NUSAP1在这些胶质母细胞瘤细胞中都呈现高表达的状态。进一步地，对NUSAP1在一组胶质母细胞瘤患者的癌旁组织和癌组织中的表达进行了检测，结果同样显示NUSAP1在胶质母细胞瘤中高表达。为了进一步判断NUSAP1在胶质母细胞瘤患者中的作用，我们通过R2数据平台对胶质母细胞瘤病人中NUSAP1的水平进行了分析。通过1个正常脑组织的数据集以及12个胶质瘤患者和细胞系的数据集对NUSAP1进行分析发现相较于正常脑组织而言，NUSAP1在胶质瘤患者以及细胞系中高表达。此外，3个不同数据集的分析显示NUSAP1在死亡病人中的表达量明显高于存活的病人。并且，NUSAP1高表达的胶质瘤患者预后较差。最后，我们对NUSAP1与胶质瘤分级的关系进行了分析，与免疫组化结果一致，NUSAP1与胶质瘤患者的分级呈正相关。这些结果进一步证明NUSAP1在胶质母细胞瘤中发挥着重要作用，可作为胶质母细胞瘤诊断、治疗和预后的分子靶标。
2.NUSAP1调控胶质母细胞瘤细胞的增殖和凋亡
NUSAP1在胶质母细胞瘤中的高表达表明NUSAP1有望作为胶质母细胞瘤诊断、治疗和预后的分子标志物。这些结果暗示我们NUSAP1可能在胶质母细胞瘤中发挥着肿瘤促进因子的作用。为了进一步证实这一猜想，我们设计了3条针对NUSAP1的shRNA，并且利用慢病毒转染技术对3个胶质母细胞瘤细胞系U-87MG，LN-229和A172中的NUSAP1进行敲低。蛋白免疫印迹结果证实3条shRNA都能够成功的对NUSAP1进行敲低。MTT实验进一步证明这3条shRNA都能够成功抑制U-87MG，LN-229和A172细胞的增殖。鉴于shNUSAP1#1呈现出最高的敲低效率，在后续实验中我们使用shNUSAP1#1对NUSAP1进行敲低。BrdU实验证明敲低NUSAP1显著抑制胶质母细胞路细胞的DNA合成能力。通过显微镜观察，NUSAP1敲低的U-87MG，LN-229和A172细胞形态均发生了显著改变，细胞数也明显减少。同时我们观察到在敲低NUSAP1的后期U-87MG，LN-229和A172细胞均出现了大量的死亡，因此我们随后通过流式细胞仪对胶质母细胞瘤细胞的凋亡情况进行了检测，结果发现敲低NUSAP1后凋亡细胞的比例明显增加。为了进一步证实这一结果，我们通过蛋白免疫印迹实验检测了凋亡相关蛋白bcl2以及凋亡的分子标记物caspase-3剪切体的水平。敲低NUSAP1之后U-87MG，LN-229和A172细胞中bcl2的表达量下调而caspase-3剪切体水平上调。此外，在敲低了NUSAP1之后我们检测了U-87MG，LN-229和A172细胞中caspase-3/7活性，与上述结果一致，敲低NUSAP1之后，细胞中caspase-3/7活性明显增强。这些结果表明敲低NUSAP1能够抑制胶质母细胞瘤细胞增殖并且引起胶质母细胞瘤细胞发生凋亡。
3.NUSAP1调控胶质母细胞瘤的DNA损伤
我们通过French’s数据库对NUSAP1相关基因集进行了分析发现NUSAP1与DNA损伤修复过程密切相关。因此，我们猜想NUSAP1可能作为DNA损伤修复进程中的一个重要调控因子，并以此来决定细胞的命运。为了证实这一假设，我们开展了彗星实验。在敲低NUSAP1之后，相较于对照组而言，大量的胶质母细胞瘤细胞出现了拖尾现象。磷酸化的H2AX(γ-H2AX)是DNA损伤修复过程中的标记分子，当发生DNA损伤时，γ-H2AX被募集到损伤部位。进一步地，通过免疫荧光实验对γ-H2AX的水平进行检测。结果显示敲低NUSAP1后γ-H2AX的阳性信号明显增加。为了进一步证实上述结果，我们检测了DNA损伤修复过程中的几个相关蛋白，结果表明敲低NUSAP1后Chk1，Chk2以及γ-H2AX都得到了明显的激活。以上结果表明敲低NUSAP1引起胶质母细胞瘤细胞发生DNA损伤。
4.NUSAP1调控胶质母细胞瘤的体外克隆形成能力以及体内成瘤能力
为了进一步研究NUSAP1能否调控胶质母细胞瘤细胞的克隆形成能力，我们开展了软琼脂克隆实验。结果显示在敲低NUSAP1后，U-87MG和LN-229细胞的体外克隆形成能力受到了明显的抑制。通过原位移植瘤模型，我们检测了NUSAP1对小鼠体内成瘤能力的影响。结果表明敲低NUSAP1显著抑制了细胞的原位成瘤能力。并且下调NUSAP1的表达明显延长了小鼠的存活时间。
5.NUSAP1通过稳定ATR调控胶质母细胞瘤细胞的生长
在前面对DNA损伤修复相关蛋白的检测过程中，我们发现在敲低NUSAP1的细胞中，ATR的水平发生了明显下调。为了进一步研究NUSAP1是否通过ATR来调控胶质母细胞瘤的生长，我们在胶质母细胞瘤细胞系U-87MG,LN-229和A172中对NUSAP1进行了过表达。在过表达NUSAP1之后，U-87MG,LN-229和A172细胞中ATR的表达发生了明显的上调。同时在这一过程中我们发现无论是敲低NUSAP1或是过表达NUSAP1，ATR在mRNA水平的表达均未发生显著变化。由此，我们推测NUSAP1是通过转录后修饰来调控ATR的表达。接下来我们通过添加蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)来检测ATR稳定性的变化，结果如预期所料，敲低NUSAP1之后，胶质母细胞瘤细胞中的ATR蛋白降解速率更快，说明ATR的稳定性明显降低。相反地，在胶质母细胞瘤细胞中过表达NUSAP1之后使得ATR更加稳定。进一步地，我们通过泛素化实验对ATR的泛素化水平进行了检测。结果表明在敲低了NUSAP1之后，ATR的泛素化水平明显增加，而过表达NUSAP1则减少了ATR的泛素化。以上结果说明NUSAP1通过抑制ATR的泛素化降解来稳定ATR的表达。为了进一步证实NUSAP1是否通过稳定ATR蛋白来调控胶质母细胞瘤细胞的生长，在敲低NUSAP1之后我们对ATR进行了过表达，结果表明过表达ATR能够挽救NUSAP1敲低细胞中γ-H2AX和caspase9剪切体的表达。进一步说明NUSAP1通过稳定ATR调控胶质母细胞瘤细胞的生长。
6.NUSAP1通过其SAP结构域促进ATR发生SUMO化进而稳定ATR
为了进一步研究NUSAP1在稳定ATR蛋白中的作用，我们通过免疫共沉淀实验对NUSAP1和ATR之间的相互作用情况进行了检测。结果显示无论是外源性的还是内源性的NUSAP1都能够与ATR进行结合。此外，我们对NUSAP1的截短蛋白和ATR的全长蛋白进行了共转染，实验结果表明NUSAP1通过其COOH末端与ATR进行结合。在NUSAP1的NH2末端包含一个SAP结构域。SAP结构域在多种SUMO化的E3连接酶中普遍存在。SAP结构域与SUMO化的底物识别和连接酶活性密切相关。前期有研究表明SUMO化能够与泛素依赖的降解作用相互拮抗。为了研究NUSAP1的SAP结构域是否通过调节ATR的SUMO化来拮抗泛素化，我们构建了缺失SAP结构域的突变体NUSAP1-ΔSAP。实验结果证明，与NUSAP1过表达的细胞相比，过表达NUSAP1-ΔSAP突变体的细胞中ATR的表达量明显下调。进一步地，与NUSAP1过表达的细胞相比，过表达NUSAP1-ΔSAP突变体后ATR的SUMO化和泛素化水平均发生了逆转。这一结果证明NUSAP1通过其SAP结构域促进ATR发生SUMO化进而稳定ATR。
7.NUSAP1通过其SAP结构域调控胶质母细胞瘤细胞的化学耐药性
以上结果表明在胶质母细胞瘤细胞中NUSAP1调控ATR的稳定性。ATR是DNA损伤和DNA损伤修复过程中必不可少的调控因子，因此在调控化学耐药性方面也发挥了重要作用。为了证实NUSAP1参与到对化疗敏感性的调控过程中，我们使用了两种化疗药物替莫唑胺和阿霉素对胶质母细胞瘤细胞进行了处理。敲低NUSAP1后，替莫唑胺和阿霉素处理过的细胞凋亡程度更高并且细胞存活能力显著降低。与对照组相比，敲低NUSAP1后胶质母细胞瘤细胞对于替莫唑胺和阿霉素两种药物的半致死浓度更低。相反地，过表达NUSAP1后，替莫唑胺和阿霉素处理过的细胞凋亡程度较低并且细胞活力增强。然而NUSAP1中SAP结构域的缺失能够部分逆转这种效果。与对照组相比，过表达NUSAP1后胶质母细胞瘤细胞对于替莫唑胺和阿霉素两种药物的半致死浓度更高。而NUSAP1中SAP结构域的缺失能够部分逆转这种情况。这些结果证明NUSAP1能够增强胶质母细胞瘤细胞的化学耐药性，并且其SAP结构域在这一过程中发挥了重要作用。为进一步证明NUSAP1通过稳定ATR来增强胶质母细胞瘤的化学耐药性。在敲低NUSAP1之后我们对ATR进行了过表达，并且同时添加替莫唑胺对细胞的凋亡进行检测。结果表明过表达ATR能够部分挽救敲低NUSAP1联合使用替莫唑胺引起的细胞凋亡。
综上所述，相较于正常脑组织而言，NUSAP1与胶质瘤的分级呈正相关。NUSAP1在胶质瘤病人，死亡的胶质瘤患者以及胶质瘤细胞中高表达。此外，NUSAP1调控胶质母细胞瘤细胞的增殖凋亡、DNA损伤和体内成瘤能力。究其机制，NUSAP1的SAP结构域通过促进ATR发生SUMO化进而稳定ATR蛋白。值得注意的是，NUSAP1能够通化其SAP结构域增强胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺和阿霉素两种药物的化疗耐药性。以上结果表明NUSAP1在胶质母细胞瘤细胞中发挥着促进肿瘤生长的作用，为NUSAP1在胶质母细胞瘤治疗中的应用提供了可行性基础。
1.NUSAP1在胶质瘤中高表达并且其高表达与胶质瘤病人的不良预后密切相关。
为了研究NUSAP1在胶质母细胞瘤中扮演的角色，我们开展了免疫组化实验。通过对8例正常脑组织以及64例胶质瘤样本中NUSAP1的表达水平的检测发现NUSAP1在胶质瘤样本中高表达，并且与胶质瘤的分级呈正相关，随着胶质瘤级别的增加NUSAP1的表达水平明显升高。我们随后对4个胶质母细胞瘤细胞系A172、U-118MG、U-87MG和LN-229中NUSAP1的表达量进行了检测，发现NUSAP1在这些胶质母细胞瘤细胞中都呈现高表达的状态。进一步地，对NUSAP1在一组胶质母细胞瘤患者的癌旁组织和癌组织中的表达进行了检测，结果同样显示NUSAP1在胶质母细胞瘤中高表达。为了进一步判断NUSAP1在胶质母细胞瘤患者中的作用，我们通过R2数据平台对胶质母细胞瘤病人中NUSAP1的水平进行了分析。通过1个正常脑组织的数据集以及12个胶质瘤患者和细胞系的数据集对NUSAP1进行分析发现相较于正常脑组织而言，NUSAP1在胶质瘤患者以及细胞系中高表达。此外，3个不同数据集的分析显示NUSAP1在死亡病人中的表达量明显高于存活的病人。并且，NUSAP1高表达的胶质瘤患者预后较差。最后，我们对NUSAP1与胶质瘤分级的关系进行了分析，与免疫组化结果一致，NUSAP1与胶质瘤患者的分级呈正相关。这些结果进一步证明NUSAP1在胶质母细胞瘤中发挥着重要作用，可作为胶质母细胞瘤诊断、治疗和预后的分子靶标。
2.NUSAP1调控胶质母细胞瘤细胞的增殖和凋亡
NUSAP1在胶质母细胞瘤中的高表达表明NUSAP1有望作为胶质母细胞瘤诊断、治疗和预后的分子标志物。这些结果暗示我们NUSAP1可能在胶质母细胞瘤中发挥着肿瘤促进因子的作用。为了进一步证实这一猜想，我们设计了3条针对NUSAP1的shRNA，并且利用慢病毒转染技术对3个胶质母细胞瘤细胞系U-87MG，LN-229和A172中的NUSAP1进行敲低。蛋白免疫印迹结果证实3条shRNA都能够成功的对NUSAP1进行敲低。MTT实验进一步证明这3条shRNA都能够成功抑制U-87MG，LN-229和A172细胞的增殖。鉴于shNUSAP1#1呈现出最高的敲低效率，在后续实验中我们使用shNUSAP1#1对NUSAP1进行敲低。BrdU实验证明敲低NUSAP1显著抑制胶质母细胞路细胞的DNA合成能力。通过显微镜观察，NUSAP1敲低的U-87MG，LN-229和A172细胞形态均发生了显著改变，细胞数也明显减少。同时我们观察到在敲低NUSAP1的后期U-87MG，LN-229和A172细胞均出现了大量的死亡，因此我们随后通过流式细胞仪对胶质母细胞瘤细胞的凋亡情况进行了检测，结果发现敲低NUSAP1后凋亡细胞的比例明显增加。为了进一步证实这一结果，我们通过蛋白免疫印迹实验检测了凋亡相关蛋白bcl2以及凋亡的分子标记物caspase-3剪切体的水平。敲低NUSAP1之后U-87MG，LN-229和A172细胞中bcl2的表达量下调而caspase-3剪切体水平上调。此外，在敲低了NUSAP1之后我们检测了U-87MG，LN-229和A172细胞中caspase-3/7活性，与上述结果一致，敲低NUSAP1之后，细胞中caspase-3/7活性明显增强。这些结果表明敲低NUSAP1能够抑制胶质母细胞瘤细胞增殖并且引起胶质母细胞瘤细胞发生凋亡。
3.NUSAP1调控胶质母细胞瘤的DNA损伤
我们通过French’s数据库对NUSAP1相关基因集进行了分析发现NUSAP1与DNA损伤修复过程密切相关。因此，我们猜想NUSAP1可能作为DNA损伤修复进程中的一个重要调控因子，并以此来决定细胞的命运。为了证实这一假设，我们开展了彗星实验。在敲低NUSAP1之后，相较于对照组而言，大量的胶质母细胞瘤细胞出现了拖尾现象。磷酸化的H2AX(γ-H2AX)是DNA损伤修复过程中的标记分子，当发生DNA损伤时，γ-H2AX被募集到损伤部位。进一步地，通过免疫荧光实验对γ-H2AX的水平进行检测。结果显示敲低NUSAP1后γ-H2AX的阳性信号明显增加。为了进一步证实上述结果，我们检测了DNA损伤修复过程中的几个相关蛋白，结果表明敲低NUSAP1后Chk1，Chk2以及γ-H2AX都得到了明显的激活。以上结果表明敲低NUSAP1引起胶质母细胞瘤细胞发生DNA损伤。
4.NUSAP1调控胶质母细胞瘤的体外克隆形成能力以及体内成瘤能力
为了进一步研究NUSAP1能否调控胶质母细胞瘤细胞的克隆形成能力，我们开展了软琼脂克隆实验。结果显示在敲低NUSAP1后，U-87MG和LN-229细胞的体外克隆形成能力受到了明显的抑制。通过原位移植瘤模型，我们检测了NUSAP1对小鼠体内成瘤能力的影响。结果表明敲低NUSAP1显著抑制了细胞的原位成瘤能力。并且下调NUSAP1的表达明显延长了小鼠的存活时间。
5.NUSAP1通过稳定ATR调控胶质母细胞瘤细胞的生长
在前面对DNA损伤修复相关蛋白的检测过程中，我们发现在敲低NUSAP1的细胞中，ATR的水平发生了明显下调。为了进一步研究NUSAP1是否通过ATR来调控胶质母细胞瘤的生长，我们在胶质母细胞瘤细胞系U-87MG,LN-229和A172中对NUSAP1进行了过表达。在过表达NUSAP1之后，U-87MG,LN-229和A172细胞中ATR的表达发生了明显的上调。同时在这一过程中我们发现无论是敲低NUSAP1或是过表达NUSAP1，ATR在mRNA水平的表达均未发生显著变化。由此，我们推测NUSAP1是通过转录后修饰来调控ATR的表达。接下来我们通过添加蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)来检测ATR稳定性的变化，结果如预期所料，敲低NUSAP1之后，胶质母细胞瘤细胞中的ATR蛋白降解速率更快，说明ATR的稳定性明显降低。相反地，在胶质母细胞瘤细胞中过表达NUSAP1之后使得ATR更加稳定。进一步地，我们通过泛素化实验对ATR的泛素化水平进行了检测。结果表明在敲低了NUSAP1之后，ATR的泛素化水平明显增加，而过表达NUSAP1则减少了ATR的泛素化。以上结果说明NUSAP1通过抑制ATR的泛素化降解来稳定ATR的表达。为了进一步证实NUSAP1是否通过稳定ATR蛋白来调控胶质母细胞瘤细胞的生长，在敲低NUSAP1之后我们对ATR进行了过表达，结果表明过表达ATR能够挽救NUSAP1敲低细胞中γ-H2AX和caspase9剪切体的表达。进一步说明NUSAP1通过稳定ATR调控胶质母细胞瘤细胞的生长。
6.NUSAP1通过其SAP结构域促进ATR发生SUMO化进而稳定ATR
为了进一步研究NUSAP1在稳定ATR蛋白中的作用，我们通过免疫共沉淀实验对NUSAP1和ATR之间的相互作用情况进行了检测。结果显示无论是外源性的还是内源性的NUSAP1都能够与ATR进行结合。此外，我们对NUSAP1的截短蛋白和ATR的全长蛋白进行了共转染，实验结果表明NUSAP1通过其COOH末端与ATR进行结合。在NUSAP1的NH2末端包含一个SAP结构域。SAP结构域在多种SUMO化的E3连接酶中普遍存在。SAP结构域与SUMO化的底物识别和连接酶活性密切相关。前期有研究表明SUMO化能够与泛素依赖的降解作用相互拮抗。为了研究NUSAP1的SAP结构域是否通过调节ATR的SUMO化来拮抗泛素化，我们构建了缺失SAP结构域的突变体NUSAP1-ΔSAP。实验结果证明，与NUSAP1过表达的细胞相比，过表达NUSAP1-ΔSAP突变体的细胞中ATR的表达量明显下调。进一步地，与NUSAP1过表达的细胞相比，过表达NUSAP1-ΔSAP突变体后ATR的SUMO化和泛素化水平均发生了逆转。这一结果证明NUSAP1通过其SAP结构域促进ATR发生SUMO化进而稳定ATR。
7.NUSAP1通过其SAP结构域调控胶质母细胞瘤细胞的化学耐药性
以上结果表明在胶质母细胞瘤细胞中NUSAP1调控ATR的稳定性。ATR是DNA损伤和DNA损伤修复过程中必不可少的调控因子，因此在调控化学耐药性方面也发挥了重要作用。为了证实NUSAP1参与到对化疗敏感性的调控过程中，我们使用了两种化疗药物替莫唑胺和阿霉素对胶质母细胞瘤细胞进行了处理。敲低NUSAP1后，替莫唑胺和阿霉素处理过的细胞凋亡程度更高并且细胞存活能力显著降低。与对照组相比，敲低NUSAP1后胶质母细胞瘤细胞对于替莫唑胺和阿霉素两种药物的半致死浓度更低。相反地，过表达NUSAP1后，替莫唑胺和阿霉素处理过的细胞凋亡程度较低并且细胞活力增强。然而NUSAP1中SAP结构域的缺失能够部分逆转这种效果。与对照组相比，过表达NUSAP1后胶质母细胞瘤细胞对于替莫唑胺和阿霉素两种药物的半致死浓度更高。而NUSAP1中SAP结构域的缺失能够部分逆转这种情况。这些结果证明NUSAP1能够增强胶质母细胞瘤细胞的化学耐药性，并且其SAP结构域在这一过程中发挥了重要作用。为进一步证明NUSAP1通过稳定ATR来增强胶质母细胞瘤的化学耐药性。在敲低NUSAP1之后我们对ATR进行了过表达，并且同时添加替莫唑胺对细胞的凋亡进行检测。结果表明过表达ATR能够部分挽救敲低NUSAP1联合使用替莫唑胺引起的细胞凋亡。
综上所述，相较于正常脑组织而言，NUSAP1与胶质瘤的分级呈正相关。NUSAP1在胶质瘤病人，死亡的胶质瘤患者以及胶质瘤细胞中高表达。此外，NUSAP1调控胶质母细胞瘤细胞的增殖凋亡、DNA损伤和体内成瘤能力。究其机制，NUSAP1的SAP结构域通过促进ATR发生SUMO化进而稳定ATR蛋白。值得注意的是，NUSAP1能够通化其SAP结构域增强胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺和阿霉素两种药物的化疗耐药性。以上结果表明NUSAP1在胶质母细胞瘤细胞中发挥着促进肿瘤生长的作用，为NUSAP1在胶质母细胞瘤治疗中的应用提供了可行性基础。