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温度依赖型性别决定(TSD)是环境性别决定(ESD)模式中的重要表现形式之一,其个体性别取决于胚胎发育过程中的环境温度,但其具体分子调控机理仍然不明确。之前对爬行动物TSD的研究,多集中在不同物种性别决定模式的描述、激素在TSD中的作用以及调控TSD基因的挖掘等方面;表观遗传学最新研究表明,非编码RNA和DNA甲基化修饰可能是爬行动物TSD模式的重要调控机制。cyp19a1基因编码产生的芳香化酶是将雄激素转化为雌激素的关键酶,是调控爬行动物TSD模式的重要基因,也是性别相关miRNAs的一个重要潜在靶基因。因此,本研究以乌龟为研究对象,在三个温度下(26℃、29℃和32℃)孵化龟卵,对乌龟的TSD模式进行验证,同时鉴定不同孵化温度下性腺差异表达的miRNAs,并且还以cyp19a1基因为候选基因,研究其甲基化修饰对乌龟性别决定的影响。本研究获得如下重要结果:1.孵化温度对乌龟性别决定的影响在26℃、29℃和32℃三个温度下孵化乌龟卵并进行性别鉴定,结果显示:26℃、29℃和32℃孵化条件下的雌性性别比率分别为3.3%、36.6%和100%,证明了乌龟属于典型的温度依赖型性别决定动物(TSD),同时属于TSD Ia类,即高温是雌性产生温度,低温是雄性产生温度,这也为后续乌龟TSD相关的表观遗传机制研究提供了基础。2.不同孵化温度下乌龟性腺中差异表达miRNAs的鉴定在乌龟孵化的温度敏感期,采集了AKG复合体样品,通过下代测序技术,分析鉴定了温度敏感期内(TSP)不同孵化温度下乌龟性腺差异表达的miRNAs。首次确定了1013个已知miRNAs和730个新miRNAs,其中有18个miRNAs在不同孵化温度下存在表达差异。通过qPCR实验证实了7个miRNAs的表达式模式与测序结果一致。对预测得到的miRNAs的靶基因进行KEGG富集分析,结果表明内吞作用和轴突引导通路可能是参与乌龟TSD过程中的重要通路。这些结果表明miRNAs可能参与了乌龟的性别决定过程。3.不同孵化温度下乌龟cyp19a1基因启动子区甲基化研究通过TA克隆和DNA测序等技术,成功克隆了乌龟cyp19a1基因5’侧翼区序列,并通过生物信息学分析预测了该区域转录起始位点及转录因子结合位点,初步确定了乌龟cyp19a1基因核心启动子区域,并利用双荧光素酶报告基因系统检测其荧光活性,结果证实了该区域具有启动子活性。通过亚硫酸氢盐测序等技术,检测了AKG复合体中cyp19a1基因启动子区在不同孵化温度下的甲基化修饰模式。结果表明,乌龟cyp19a1基因启动子区3个CpG位点的整体甲基化水平在不同孵化温度间存在显著差异,雌性孵化温度下(32℃)的甲基化发生率极显著低于雄性孵化温度(26℃)(P<0.01),并且显著低于中间温度(29℃)(P<0.05)。实时定量PCR及ELIAS结果表明,在雌性孵化温度下(32℃),cyp19a1基因的表达量及雌激素水平显著高于雄性孵化温度(26℃)及中间温度(P<0.01)。以上试验结果表明雌性孵化温度(FPT)能够通过降低cyp19a1基因启动子区的甲基化水平,来提高cyp19a1基因的表达水平以及雌激素水平,从而进一步决定乌龟的性别。这证明了cyp19a1基因启动子区的甲基化修饰对孵化温度的响应,可能是乌龟TSD的重要调控机制。