里氏木霉是用于工业生产的高产纤维素酶菌株。在纤维素酶基因表达过程中,受到多种层面的调节,包括诱导信号的感应、信号转导、转录调控等。转录因子如Xyr1,Ace1,Cre1,Vib1等,是通过结合到纤维素酶基因的启动子区域对其表达进行调控的。Crel作为里氏木霉中最主要的转录抑制因子,其在碳源代谢阻遏（CCR）中有着十分重要的作用,但Cre1缺失菌株对菌体的生长产生严重影响,因此Crel是具有双功性的转录调控因子。但在工业生产过程中,在不影响菌体生长条件下CCR的解除是一个十分关键的问题,然而目前没有找到很好的方法,并且对Crel在CCR中的机制研究并不清晰。而在二代乙醇生产的方法中,最后一步是通过酵母将可发酵糖发酵产生乙醇。由于可发酵糖进入酵母细胞无法通过简单扩散直接进入细胞,而需要载体将可发酵糖从胞外运送到胞内。因此通过糖转运蛋白对糖的运送成为酵母发酵产生乙醇的第一步,也是十分重要的步骤。木质纤维素原料通过酶解主要产生大量的可发酵糖中含量最多的是葡萄糖和木糖。而酿酒酵母中缺少可以高效利用木糖的特异性木糖转运蛋白,木糖的转运大多是由具有非特异性的葡萄糖转运蛋白来运送的,因此木糖的转运存在着十分严重的葡萄糖抑制现象。因此找到可以高效转运木糖或者可以解除葡萄糖抑制的糖转运蛋白成为今年来科学家们的研究热点。基于以上问题,本论文主要开展了如下几个方面的研究:1)里氏木霉转录因子Cre1缓解碳源代谢阻遏（CCR效应）的研究里氏木霉中的Cre1是一个全局性转录调控因子,对菌体的生长、孢子萌发等生理过程有着重要作用,同时参与纤维素酶基因表达的调控,通过与主要纤维素酶基因cbh1的启动子区域结合,来抑制纤维素酶基因的表达,实现葡萄糖条件下的碳源代谢阻遏效应,同时有实验表明Cre1也参与了转录激活因子XYR1及ACE2的调节。蛋白质的磷酸化修饰在生命活动中具有重要的功能,同样对于转录因子的调节也具有十分重要的作用。里氏木霉的Cre1也是一个磷酸化蛋白,据报道,Crel的241位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸后,其不需被磷酸化就可以与cbh1基因结合,导致CBH1表达被永久性抑制;244位氨基酸由谷氨酸突变为缬氨酸后,Cre1无法被磷酸化,也无法结合DNA,因而发现碳源代谢阻遏现象发生了明显下调。本实验室前期对Cre1解除碳代谢阻遏效应进行了探究,基于草酸青霉中的高产菌株JU-A10的来源,发现其与114-2菌株相比,CreA发生了移码突变,缓解了碳源代谢阻遏效应。因此在里氏木霉中进行了类比工作,将里氏木霉中的Cre1 386位点氨基酸之后的序列进行了截短和延长,发现葡萄糖条件下,主要纤维素酶基因的转录水平发生了明显地提高,有效地缓解了碳源代谢阻遏效应。我们对Cre1蛋白386位之后的氨基酸进行了磷酸化位点的预测,发现存在5个潜在的磷酸化位点,因此我们推测CCR效应的缓解有可能是因为磷酸化位点的缺失导致。为了验证这个假说,我们在里氏木霉菌株中构建了潜在磷酸化位点突变的菌株,以模拟转录因子的去磷酸化。首先研究了其在不同碳源培养条件下的菌丝生长、表型观察及其生孢情况的测定,但并未发现十分明显的变化,说明突变后对菌株的生长影响较小。接下来,我们主要研究了不同时间点转录水平在葡萄糖及其微晶纤维素培养条件下,突变前后对于主要纤维素酶基因及转录因子的变化。在葡萄糖培养12h时,主要纤维素酶基因包括cbh1、cbh2、egl1、egl2以及bgl1均发生了上调,其中cbh2及其eg2最为显著,上调水平达到了 150倍左右。说明突变后缓解了葡萄糖条件下对与纤维素酶基因及其调控因子的转录抑制。同时我们检测了突变菌株在纤维素条件下的转录及其酶活水平,发现突变前后纤维素酶基因及转录因子在转录水平及酶活水平未发生明显变化。因此,Cre1突变后在葡萄糖条件下缓解了对纤维素酶基因及其调控因子的抑制作用。2)里氏木霉中高效糖转运蛋白的研究糖的转运环节作为糖进入细胞的首要步骤,具有十分重要的作用。在木质纤维素降解生产乙醇的过程中,木质纤维素经酶解得到的水解液中含有大量的葡萄糖及木糖等可发酵糖,而对于野生型酿酒酵母没有木糖代谢途径,为了实现酵母对于木糖的共利用,科学家们通过代谢工程的研究对木糖代谢途径进行了改造并导入酿酒酵母,实现了酵母对木糖的利用（Li et al.,2019）。另外一个问题对木糖分子的高效导入,成为了对木糖利用的主要限速步骤之一。而酿酒酵母中的木糖转运是要通过内源的己糖转运蛋白进行,其中效率较高的是Gal2蛋白,但是也存在转运效率低的现象,并且会受到严重的葡萄糖抑制现象,因此影响了木糖的利用效率。因此,筛选外源的具有高效转运能力的糖转运蛋白成为大家研究的热点。天然能够利用木糖的微生物被认为是良好的转运蛋白的来源。而随着基因组水平研究越来越清晰,发现很多具有转运蛋白特征的潜在蛋白来自于自丝状真菌,其中许多可以吸收并利用木糖。因此我们便在常应用于工业纤维素酶酶制剂来源的里氏木霉中进行高效糖转运蛋白的发掘,并对其高效转运机理进行了进一步研究。基于粗糙脉孢菌中高低系统糖转运蛋白的研究,我们在里氏木霉中对里氏木霉基因组进行了挖掘,发现了 3个未曾研究过的可能的糖转运蛋白。首先我们通过生物信息学对其跨膜结构进行了分析,发现这3个转运蛋白均具有12个跨膜结构,属于典型的MFS家族转运蛋白。接下来我们将这3个转运蛋白在酿酒酵母中进行了表达及其功能的鉴定分析。我们将蛋白C末端加上了 GFP荧光标签,通过细胞定位实验发现,3个转运蛋白均正确表达在细胞膜上。然后在不同碳源的培养条件下进行表型分析,发现Xltrlp表达菌株FJTR3Xltr1可以在多种己糖条件（包括葡萄糖、果糖、甘露糖）上生长,而另外两个转运蛋白无明显的生长。接下来我们对3个蛋白进行了木糖转运能力的测定,发现只有Xltrlp具有木糖的转运能力,且在120min的胞内木糖积累量比酿酒酵母内源的Gal2转运量高8.44倍。为了分析其高效转运的原因,我们对其转运类型进行了鉴定,结果发现Xltrlp属于单向异化扩散型转运蛋白,无需H离子的协助。属于此类型的转运蛋白对木糖的转运一般亲和力较低,但对木糖的转运效率较高。同时,我们通过生物信息学分析对木糖的保守性位点进行了分析,且对其结构进行了预测,结合对二者的分析我们选择了 13个氨基酸位点对其突变,从而研究其在糖转运过程中的重要性。通过突变我们发现,所选择的大多数位点对于木糖的转运具有十分重要的作用。我们发现,其中某些位点对于木糖或者己糖的转运是具有特异性的,比如F300的突变,使得木糖转运能力丧失却保留了较高的葡萄糖转运水平;而N326突变为F后,保留了较高的木糖转运能力,而丧失了葡萄糖的转运能力;而且还发现了 N434位点对于己糖及其木糖的转运都具有十分重要的作用,与木糖分子之间存在着氢键作用力,与葡萄糖分子之间存在着疏水作用力。另外,我们对Xltrlp在不同己糖条件下的转运进行了实验。我们发现在使用不同的己糖作为单独碳源利用时,糖的利用速率是相似的,但在混合己糖的培养条件下,糖的利用率为葡萄糖>甘露糖>果糖。并且我们测试了不同位点突变对于己糖转运的影响,以证明不同的氨基酸位点在己糖转运过程中的功能。实验发现,突变如下位点后丧失在己糖条件下的转运（葡萄糖、果糖或甘露糖）:D39A,R132A,Q292Y/W,F298A,1299A,Y301A,Y302A,N326F/Y/W,W407A和N434A。由于甘露糖在工业中具有较高的价值,而目前的分离方法大多使用化学法将钥酸盐异构葡萄糖制备甘露糖并且使用移动模拟床进行分离,这种方法生产成本高且分离困难。因此在保留转运能力的突变菌株中,我们进一步测量了它们在混合己糖条件下（葡萄糖及甘露糖）的糖转运及利用情况,发现FJTR3Xltr1pQ291A菌株实现了混合糖的分离,将葡萄糖利用并剩余约70%左右的甘露糖,并且产生了具有附加值的产品——乙醇。进一步,我们可以通过蒸馏,将乙醇进行回收,最终剩余甘露糖,从而实现混合糖的分离,并有伴有高附加值乙醇的产出。整个过程简单且伴有高附加值产品产生,且实现了混合糖的分离。3)开发了一种从农业废弃物马铃薯渣生产高附加值葡萄糖酸的方法马铃薯渣是淀粉生产过程中产生的废弃物,由于难以处理,所以多被作为垃圾直接排掉,不仅造成了资源浪费,还带来了环境污染的问题。而我国马铃薯产量占据全球的1/5以上,因此每年的淀粉生产过程中会产生大量的马铃薯残渣。因此我们尝试开发一种新的绿色可持续的方法,将马铃薯废弃物生产具有高附加值的产品。本论文中,通过成分分析发现马铃薯渣的主要成分为淀粉、果胶及纤维素,因此我们使用了来源于里氏木霉TX及草酸青霉JUA10-1的纤维素酶混合酶液及其商业果胶酶共同酶解马铃薯渣,产生的水解液进一步由氧化葡糖杆菌DSM 2003进行发酵,将水解液中的可发酵糖发酵产生葡萄糖酸,且实现了由葡萄糖到葡萄糖酸的最高转化率94.9%。因此我们成功开发出了一种高效、绿色、可持续的由废弃物马铃薯渣生产葡萄糖酸的方法。