山羊痘是一种急热性传染病,由山羊痘病毒(goatpox virus, GTPV)引发,临床上以出现发热和全身起痘为典型特征,具有很高的发病率和死亡率。我国目前使用山羊痘弱毒疫苗AV41株来预防山羊痘,但其在我国部分省份尤其是南方部分地区的羊痘防疫过程中,发现存在有安全隐患,可产生诸多不良反应,如全身发痘、孕羊流产等。因此,有必要进一步研制更为安全有效的新型基因工程疫苗。本研究利用分子生物学、病毒学和免疫学等方面的技术和手段,以GTPV弱毒疫苗毒株AV41为模板,分别设计4对引物,PCR扩增ORF5～ORF19和ORF149～ORF15两个区域两侧共四个基因组片段,分别作为同源重组左侧臂和右侧臂；运用分子技术,分别将两侧重组臂相连,并在两个重组臂中间插入报告基因EGFP和筛选基因gpt的表达盒,构建转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg；分别将转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg与GTPV AV41株共转染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),使其在细胞内发生同源重组,加压筛选并纯化重组GTPV；最后鉴定重组GTPV和检测其生物学特性。通过一系列实验研究,确定了GTPV基因组中的两个病毒复制非必需区,分别成功构建了敲除掉GTPV毒力相关基因ORF5～ORF19之间共15个ORF和ORF149～ORF151之间共3个ORF的两株重组山羊痘弱毒株。同时证实这两个基因重组缺失毒株均可稳定遗传,并保持了亲本毒株在细胞培养物中的生长特性。这为研制更安全、高效的山羊痘基因工程弱毒疫苗奠定基础,并为开发羊痘活载体疫苗提供了理想的载体。