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目的：蛛网膜下腔出血（Subarachnoid haemorrhage，SAH）是出血性脑卒中中的常见病之一，具有高发病率、高致死致残率的特点。既往研究认为脑血管痉挛（cerebral vasospasm，CVS)是导致SAH后致残和致死的首要原因，其与 SAH 后迟发的缺血性神经功能缺损（Delayed ischemic neurological deficit，DIND) 密切相关。过去的几十年间，虽然平滑肌松弛药物如钙拮抗剂，激酶抑制剂和内皮素受体拮抗剂广泛应用于临床，SAH总体的预后并没有明确改善，提示除了CVS，更复杂的原因可能与SAH后不良预后相关。近年来的研究认为， SAH后脑血管自动调节功能失衡是导致SAH后DIND、脑肿胀、血管源性脑水肿等的主要原因。血管平滑肌细胞 (Vascular smooth muscle cells VSMCS)作为维持血管功能的主要组成部分，在保持脑血管舒缩反应的稳定性、调节脑血流方面起关键作用。高迁移率蛋白1 （ high mobility group box-1，HMGB1）被证实与多种血管性及脑部疾病的病理演变相关。本研究通过构建大鼠SAH模型及体外VSMC培养模型，探讨SAH后HMGB1在脑血管重塑和早期脑损伤（Eary brain injury, EBI）中的作用及机制，为临床治疗SAH后DIND及EBI提供新的思路。
方法：
1、成年雄性SD大鼠，采用颈内动脉穿刺法构建SAH模型，并通过尾静脉注射 HMGB-1 单克隆抗体组（ Anti-HMGB1 monoclonal antibody，anti-HMGB1mAb）1mg/Kg。使用改良加西亚评分（Modified Garcia test ）和平衡木评分（beam balance test）检测大鼠神经功能缺失情况。取基底动脉及皮层脑组织提取组织总蛋白及总mRNA。荧光定量 PCR 法测定基底动脉 HMGB1, 晚期糖基化终末产物受体（ Receptor for advanced glycation end products, RAGE ） , Toll样受体4 （Toll like receptor 4,TLR4）, NF-κB (Nuclear factor-κB,NF-κB),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin ,α-SMA),骨桥蛋白（ Osteopontin ， OPN), 平滑肌肌球蛋白重链（ Smooth muscle myosin heavy chain ， SM-MHC) 和 胚胎形肌球蛋白重链（Embryonic smooth muscle myosin heavy chain，Smemb)基因表达。Western Blot法检测基底动脉VSMC表型转化的标记蛋白a-SMA、Smemb、SM-MHC、OPN，以及HMGB1、PAR-1、TXA2、AT1表达。免疫荧光双标法检测基底动脉收缩型表型标志蛋白OPN及Smemb表达。制备脑干石蜡切片，测定基底动脉管径及管壁厚度。
2、取皮层脑组织提取总蛋白，Western Blot法检测HMGB1及钙离子结合调节因子（Ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1）表达。免疫荧光法检测HMGB1、Iba1表达。脑组织石蜡切片TUNEL染色测定皮层细胞凋亡。
3、制备基底动脉动脉环，采用血凝酶刺激实验测血管收缩反应性。
4、采用印度墨水灌注法灌注基底动脉，观察基底动脉血管充盈连续性,采用激光多普勒测皮层脑血流情况，干湿重法测脑组织含水量。
5、培养原代SD大鼠脑基底动脉VSMCs。采用不同浓度HMGB1蛋白(5μM，10μM，15μM)培样24小时。然后将细胞随机分为sham， HMGB1，HMGB1+a-HMGB1，HMGB1+a-HMGB1+SC79四组。为明确HMGB1诱导细胞表型转化机制，于HMGB1加入前30分钟将1μm a-HMGB1mAb和1μm SC79（PI3K/AKT激动剂）分别加入HMGB1+a-HMGB1和HMGB1+a-HMGB1+SC79组，共同培养24小时后采用western-blotting法测测各组p-AKT/AKT，α-SMA，OPN，SM-MHC和Smemb的表达。
结果：
1、SAH以后基底动脉HMGB1及相关的炎性因子（RAGE、TLR4、NF-κB）表达明显增加，血管收缩相关受体(PAR-1、TXA2、AT1)表达量升高，基底动脉中α-SMA及SM-MHC表达明显减少，OPN及Smemb表达明显增加。基底动脉存在明显的病理性重塑（管腔明显变窄，管壁厚度明显增加）。应用a-HMGB1mAb治疗后能明显抑制上述改变。
2、SAH以后皮层HMGB1表达量明显增加，荧光双标显示其表达主要定位于神经元。SAH后皮层小胶质细胞明显活化（Iba1表达量及阳性细胞数明显增加），a-HMGB1mAb能明显减轻皮层脑胶质细胞活化及减少SAH后皮层细胞凋亡，改善SAH后神经功能评分。
3、SAH组大鼠基底动脉首次收缩血凝酶浓度（145 ± 23 μU/m L）明显低于正常对照组（1246 ± 54μU/m L），a-HMGB1mAb治疗后血凝酶刺激浓度（720 ± 49μU/m L）明显增加。
4、正常情况下基底动脉充盈良好，管壁无明确充盈缺损及断续表现。SAH后血管充盈明显差，部分区域出现断续表现，同时皮层脑血流减少。a-HMGB1mAb治疗后血管充盈缺损及断续表现明显好转，同时皮层脑血流量增加，脑组织含水量降低。
5、体外实验结果表明，10μM HMGB1蛋白能最大程度的刺激培养大鼠脑基底动脉VSMCs表型转化和上调培养VSMCs中p-AKT表达。a-HMGB1mAb能抑制HMGB1导致的表型转化和下调p-AKT表达，SC79能部分抑制a-HMGB1mAb的作用。
结论：
1、a-HMGB1mAb明显抑制大鼠SAH后基底动脉炎症，减轻基底动脉VSMC表型转化，同时可以降低基底动脉管壁的厚度和血管狭窄的程度，改善SAH后基底动脉的灌注，从而改善脑皮层血流，减轻SAH后脑水肿。
2、a-HMGB1mAb明显抑制大鼠SAH后皮层炎性反应，减轻细胞凋亡，改善SAH后神经功能缺失。
3、a-HMGB1mAb能减轻SAH后血管收缩反应，其机制可能与其抑制皮层收缩相关受体（PAR-1、TXA2、AT1）表达增加有关。
4、HMGB1通过PI3K/AKT通路调控SAH后脑血管VSMC表型转化和脑血管重塑。
方法：
1、成年雄性SD大鼠，采用颈内动脉穿刺法构建SAH模型，并通过尾静脉注射 HMGB-1 单克隆抗体组（ Anti-HMGB1 monoclonal antibody，anti-HMGB1mAb）1mg/Kg。使用改良加西亚评分（Modified Garcia test ）和平衡木评分（beam balance test）检测大鼠神经功能缺失情况。取基底动脉及皮层脑组织提取组织总蛋白及总mRNA。荧光定量 PCR 法测定基底动脉 HMGB1, 晚期糖基化终末产物受体（ Receptor for advanced glycation end products, RAGE ） , Toll样受体4 （Toll like receptor 4,TLR4）, NF-κB (Nuclear factor-κB,NF-κB),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin ,α-SMA),骨桥蛋白（ Osteopontin ， OPN), 平滑肌肌球蛋白重链（ Smooth muscle myosin heavy chain ， SM-MHC) 和 胚胎形肌球蛋白重链（Embryonic smooth muscle myosin heavy chain，Smemb)基因表达。Western Blot法检测基底动脉VSMC表型转化的标记蛋白a-SMA、Smemb、SM-MHC、OPN，以及HMGB1、PAR-1、TXA2、AT1表达。免疫荧光双标法检测基底动脉收缩型表型标志蛋白OPN及Smemb表达。制备脑干石蜡切片，测定基底动脉管径及管壁厚度。
2、取皮层脑组织提取总蛋白，Western Blot法检测HMGB1及钙离子结合调节因子（Ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1）表达。免疫荧光法检测HMGB1、Iba1表达。脑组织石蜡切片TUNEL染色测定皮层细胞凋亡。
3、制备基底动脉动脉环，采用血凝酶刺激实验测血管收缩反应性。
4、采用印度墨水灌注法灌注基底动脉，观察基底动脉血管充盈连续性,采用激光多普勒测皮层脑血流情况，干湿重法测脑组织含水量。
5、培养原代SD大鼠脑基底动脉VSMCs。采用不同浓度HMGB1蛋白(5μM，10μM，15μM)培样24小时。然后将细胞随机分为sham， HMGB1，HMGB1+a-HMGB1，HMGB1+a-HMGB1+SC79四组。为明确HMGB1诱导细胞表型转化机制，于HMGB1加入前30分钟将1μm a-HMGB1mAb和1μm SC79（PI3K/AKT激动剂）分别加入HMGB1+a-HMGB1和HMGB1+a-HMGB1+SC79组，共同培养24小时后采用western-blotting法测测各组p-AKT/AKT，α-SMA，OPN，SM-MHC和Smemb的表达。
结果：
1、SAH以后基底动脉HMGB1及相关的炎性因子（RAGE、TLR4、NF-κB）表达明显增加，血管收缩相关受体(PAR-1、TXA2、AT1)表达量升高，基底动脉中α-SMA及SM-MHC表达明显减少，OPN及Smemb表达明显增加。基底动脉存在明显的病理性重塑（管腔明显变窄，管壁厚度明显增加）。应用a-HMGB1mAb治疗后能明显抑制上述改变。
2、SAH以后皮层HMGB1表达量明显增加，荧光双标显示其表达主要定位于神经元。SAH后皮层小胶质细胞明显活化（Iba1表达量及阳性细胞数明显增加），a-HMGB1mAb能明显减轻皮层脑胶质细胞活化及减少SAH后皮层细胞凋亡，改善SAH后神经功能评分。
3、SAH组大鼠基底动脉首次收缩血凝酶浓度（145 ± 23 μU/m L）明显低于正常对照组（1246 ± 54μU/m L），a-HMGB1mAb治疗后血凝酶刺激浓度（720 ± 49μU/m L）明显增加。
4、正常情况下基底动脉充盈良好，管壁无明确充盈缺损及断续表现。SAH后血管充盈明显差，部分区域出现断续表现，同时皮层脑血流减少。a-HMGB1mAb治疗后血管充盈缺损及断续表现明显好转，同时皮层脑血流量增加，脑组织含水量降低。
5、体外实验结果表明，10μM HMGB1蛋白能最大程度的刺激培养大鼠脑基底动脉VSMCs表型转化和上调培养VSMCs中p-AKT表达。a-HMGB1mAb能抑制HMGB1导致的表型转化和下调p-AKT表达，SC79能部分抑制a-HMGB1mAb的作用。
结论：
1、a-HMGB1mAb明显抑制大鼠SAH后基底动脉炎症，减轻基底动脉VSMC表型转化，同时可以降低基底动脉管壁的厚度和血管狭窄的程度，改善SAH后基底动脉的灌注，从而改善脑皮层血流，减轻SAH后脑水肿。
2、a-HMGB1mAb明显抑制大鼠SAH后皮层炎性反应，减轻细胞凋亡，改善SAH后神经功能缺失。
3、a-HMGB1mAb能减轻SAH后血管收缩反应，其机制可能与其抑制皮层收缩相关受体（PAR-1、TXA2、AT1）表达增加有关。
4、HMGB1通过PI3K/AKT通路调控SAH后脑血管VSMC表型转化和脑血管重塑。