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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种全世界公认的食源性病原菌之一,可造成许多食品安全问题。同时,随着抗生素的滥用,金黄色葡萄球菌已进化为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S.aureus,MRSA）等多种耐药菌株。MRSA是食品安全、动物健康和现代医疗保健等领域出现的新问题,需要开发新的抗菌药物来取代过度使用的传统抗生素。近年来,针对MRSA等食源性病原菌迫切需要新型杀菌、控菌技术的研发。噬菌体裂解酶被认为是一种很有前途的抗菌剂。本文筛选了一株烈性的MRSA噬菌体,并根据其基因组序列构建表达噬菌体裂解酶及其各功能域,根据各功能域的酶学性质,深入研究其在不同领域的应用,为裂解酶及其功能域在食品及医药中应用提供一定的理论基础。主要研究内容和结果如下:1、金黄色葡萄球菌噬菌体筛选鉴定:从食源性垃圾中筛选到一株烈性噬菌体Z,可裂解MRSA,其效价约105。透射电镜显示此噬菌体属于长尾噬菌体,尾长约200 nm,头部直径约80 nm。在平板上能够完全抑制宿主菌生长。通过测定和分析噬菌体Z的基因组序列,获得噬菌体裂解酶lysz基因,并成功构建含lysz基因的质粒p ET15b-LysZ,通过转化、诱导表达、分离纯化获得了裂解酶LysZ。该酶可裂解包括普通金黄色葡萄球菌和MRSA在内的七种金黄色葡萄球菌,最适温度为35oC,最适p H为6.0。LysZ是金属依赖型酶。LysZ的活性随着离子强度的升高逐渐升高。裂解酶LysZ在牛奶体系中的活性与牛奶组分NaCl（0.049%）。牛奶的低盐环境也会造成裂解酶失活,但在牛奶中加入NaCl后,LysZ活性恢复。2、牛奶体系中裂解酶活性与裂解域和结合域的相关性研究。利用重叠延伸PCR技术成功构建含egfp和cbdz基因的质粒p ET15b-EGFP-CBDz,通过转化、诱导表达、分离纯化获得了结合域EGFP-CBDz,此蛋白可以与金黄色葡萄球菌特异性结合,特异性结合的最适温度为30oC,最适p H为4.0,结合能力随着溶液中离子强度的增高而升高。在牛奶中,随着牛奶中NaCl含量的升高,结合域结合MRSA活性增强。因此,裂解酶在低离子强度下活性较低,可能与结合域在此条件下与细胞壁结合能力较弱有关。噬菌体裂解酶裂解域CHAPLysZ也具有杀灭普通金黄色葡萄球菌和MRSA的特性,其最适温度为40oC,最适p H为9.0。CHAPLysZ也属于金属依赖型酶。CHAPLysZ对离子强度高度敏感,与裂解酶相反,随着离子强度的升高,其活性逐渐降低。CHAPLysZ的活性不受牛奶组分NaCl和乳脂肪的影响,在不另外添加NaCl的全脂乳和脱脂乳中均可发挥其裂解活性,减少MRSA的污染。3、金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶在非酸性食品中应用策略的选择。研究了噬菌体裂解酶在不同盐含量肉制品中的杀菌能力,CHAPLysZ（0.4 nmol/cm2）和LysZ（0.4nmol/cm2）可分别用于新鲜猪肉和盐含量高达10%以上的腊肉中,4oC培养2 h均可分别将MRSA从104CFU/cm2降至0 CFU/cm2。在实际应用中针对非酸性食品中的盐含量不同可以根据LysZ和CHAPLysZ对离子强度的敏感性选择不同的抗菌剂控制金黄色葡萄球菌的污染:低盐食品中,可以使用CHAPLysZ,而高盐食品中可以选择LysZ。清除生产环境、设备上的生物膜可以减少食品加工过程中金黄色葡萄球菌的污染。不同的金黄色葡萄球菌菌株生成生物膜的能力各不相同,本文所用七株金黄色葡萄球菌菌株中MRSA 2102生成的生物膜最不易被裂解酶或裂解域清除,其对甲氧西林的MIC高达128μg/m L。CHAPLysZ单独使用或者与甲氧西林联合去除生物膜的能力优于LysZ。0.05 n M CHAPLysZ联合32μg/m L的甲氧西林协同增效可清除约98%以上MRSA 2102形成的生物膜,这可能与裂解域的大小和裂解机理有关。裂解域可以通过生物膜内小孔隙进入生物膜内部,并不需要与细菌细胞壁结合即可发挥裂解作用。4、噬菌体裂解酶与裂解域可用于清除皮肤伤口上的MRSA,减少MRSA的感染,促进伤口愈合,可减少由外伤感染带来的污染引发的食品安全问题。1 nmol/cm2裂解酶LysZ可以促进小鼠伤口的愈合,作用一天可减少大约2.5 Log10 CFU的菌体,而裂解域CHAPLysZ仅减少0.4 Log10 CFU。可能是因为人体细胞液的离子强度较高,裂解酶LysZ更适合于应用于体内减少MRSA的污染。5、合成一种可以与MRSA细胞壁特异性结合的金纳米颗粒Au@PEG@EGFP-CBDz,此材料呈二维三角形状,平均水合粒径为72.32 nm,Zeta电位为-5.08 m V,在808 nm激光辐照下具有良好的光热转化效应,其升温速度和温度与材料浓度及激光功率成正比,此材料具有较好的生物相容性,不影响细胞的活力。在含1×104MRSA的模拟体系中加入50μg/m L金纳米颗粒Au@PEG@EGFP-CBDz分别接受NIR激光（808nm,1 W/cm2）辐照300 s,360 s,和420 s,可以分别使MRSA降低约1.2 Log10CFU,1.6 Log10CFU和3.1 Log10CFU,特异性杀灭MRSA。金纳米颗粒Au@PEG@EGFP-CBDz可作为靶向蛋白特异性结合小鼠肺部感染的MRSA,通过光辐照靶向杀灭MRSA,减少其引起的肺部细菌感染,并减少由MRSA感染带来的炎症反应,促进机体的好转。