论文部分内容阅读
目的： 诱导人胚胎干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞是目前生殖生物学与糖尿病研究领域的前沿课题，它为通过细胞替代治疗糖尿病提供新的途径。多种诱导方法不断被尝试，但获得细胞多为不成熟的胰岛分泌细胞前体细胞。本文探讨磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002对人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,HESC)定向分化为胰岛素分泌细胞的影响，尝试获得功能更加成熟的胰岛素分泌细胞。 方法： 体外通过五个阶段诱导人胚胎干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞。人胚胎干细胞培养在由3000γ射线灭活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上。人胚胎干细胞培养体系:80％knockout DMEM、20％血清替代品、2mM谷氨酰胺、0.1mM2-巯基乙醇、1％非必须氨基酸和4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。细胞融合80％时，用1mg/ml胶原酶IV消化后，转入细菌培养皿悬浮培养7天形成拟胚体（EB），其培养体系为:DMEM/F12（1:1）、20％血清替代品、2mM谷氨酰胺和1％非必须氨基酸。在无血清培养体系下将形成的EB移至0.1%明胶包被的10cm培养皿中,培养体系：DMEM／F12、2mM谷氨酰胺、5μg/ml纤粘连蛋白和1% ITS，对巢蛋白阳性细胞进行筛选(ITS)。之后进行巢蛋白阳性细胞扩增(N2)。最后去除bFGF，分别给予尼克酰胺+B27（B27组）为对照组和尼克酰胺+LY294002(LY组)为实验组诱导胰岛素分泌细胞的成熟。显微镜下观察各阶段细胞形态变化，免疫荧光染色分析胰岛细胞特异蛋白的表达；通过体外胰岛素诱导释放实验初步评价细胞的分化及其功能。 结果： 通过ITS条件培养液筛选出巢蛋白阳性细胞，细胞免疫荧光可呈现细胞核的胰岛素阳性染色和核膜的巢蛋白阳性染色且两者呈共染状态。诱导分化第4阶段添加bFGF以后巢蛋白阳性细胞进入快速增长期，第7天表现为胰岛素的核膜染色，细胞核中心逐渐淡染，巢蛋白逐渐呈现出核膜与细胞核的全染状态。诱导第五阶段7天后，LY组胰岛素免疫荧光单染阳性率为（82.7±17.5）%高于B27组的（52.6±14.6）%（P<0.05），但LY组生长抑素和胰高血糖素单染阳性率，胰岛素/生长抑素共染率和c-肽/胰高血糖素共染率分别低于B27组（P<0.05）。诱导第五阶段14天后，LY组胰岛素免疫荧光单染阳性率与B27组胰岛素单染阳性率差异无统计学意义，但生长抑素和胰高血糖素单染阳性率，胰岛素/生长抑素共染阳性率仍低于B27组（P<0.05）。B27组和LY组各诱导1周以后，在高糖（25mM）DMEM培养液中培养1小时后，LY诱导组细胞胰岛素释放量高于 B27诱导组，分别为428.3±43.9μIU/ml/mg蛋白及259.2±18.5μIU/ml/mg蛋白，两组之间差异具有统计学意义(p<0.05)；2.5小时后， LY诱导组细胞胰岛素释放量仍高于 B27诱导组细胞，分别为515.3±24.0μIU/ml/mg蛋白及258.7±17.8μIU/ml/mg蛋白，差异具有统计学意义(p<0.05)，体外可以检测到胰岛样细胞具有胰岛素释放的功能。 结论： 在无血清培养体系下，磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002能够诱导人胚胎干细胞在体外分化为更加成熟的胰岛素分泌细胞。