论文部分内容阅读
【摘要】 目的 探讨P53阳性表达对结肠癌早期肝转移的预测价值。方法 采用免疫组化Elivision法检测52例结肠癌标本的P53表达，并完成2年随访，对其表达率行相关性分析。结果 P53的阳性表达在大肠癌Dukes分期、淋巴结有无肿瘤细胞转移及随访2年后有无肝转移中均有显著性差异(P<0.05)。 结论 P53的表达对结肠癌早期肝转移有一定的预测作用，有益于临床对结肠癌的评估、治疗。
【关键词】 P53；结肠癌肝转移；预测
文章编号：1003-1383(2007)02-0122-03
中图分类号：R 735.35 文献标识码：A
结肠癌是我国较常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居第5位，在消化道恶性肿瘤中居第3位。其中结肠癌合并肝转移相当常见,15%—25%的结直肠癌患者在原发肿瘤诊断时即有肝转移,20%左右的患者在原发肿瘤治疗后随访期出现肝转移［1］,20%—35%的患者表现出肝脏为唯一转移部位［2］。目前在结肠癌肝转移早期尚无有效检测措施，寻找预测结肠癌肝转移的指标对指导临床治疗、提高结肠癌患者的预后具有重要意义。我们应用免疫组化，检测52例结肠癌组织及淋巴结中P53的表达，并且对随访满2年的患者进行P53表达的重新统计，探讨P53的表达与结肠癌发展、结肠癌肝转移之间的关系。
材料与方法
1.材料 收集我院2002年4月—2004年5月期间手术切除原发性结肠癌标本52例，所有病例术前均未行化疗、放疗或免疫治疗，术前肝功能Child分期均为A期，术前B超或CT、术中探查均未提示肝转移，术后结肠癌均经病理证实。52例中男性36例，女性16例，年龄38—72岁，平均年龄50.5岁。到2006年6月止，52例随访中完成随访46例，失访6例，随访率88.46％，随访期间患者均实行5-FU/CF联合化疗。
2.方法 52例新鲜标本用10％福尔马林常规固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，载玻片经多聚-L-赖氨酸防脱片处理。①石蜡切片80℃烤片30 min。②组织切片脱蜡，梯度酒精脱水：放入二甲苯15 min×3次，放入100%乙醇×2次，95％乙醇×2次，80％乙醇×1次，流水冲洗5 min。③抗原修复：0.1 mol/L枸橼酸缓冲液pH 6.0。操作步骤：电饭煲于耐高温塑料切片架上，放入盛有酸缓冲液的耐高温容器皿内，再放入电饭煲中煮10 min，拔去电源插头，保温20 min，取出后冷却至室温。④蒸馏水洗，磷酸缓冲液(PBS)洗，3 min×2次。⑤滴加一抗50—80 μl/张切片，湿盒孵育，4℃冰箱过夜。⑥次日晨，PBS洗3遍，滴加二抗59—80 μl/张切片，湿盒孵育，室温l h左右。⑦PBS洗3遍，滴加100 μl新鲜配制的DAB显色3—10 min。⑧自来水冲洗，苏木精复染15 s，盐酸乙醇分化3 s，温水兰化，梯度乙醇脱水，80％乙醇→乙醇95％→纯乙醇，吹干，中性树胶封固。⑨镜检。
3.阳性结果判断 免疫组化染色采用Elivision法，鼠抗人单克隆抗体P53(MAB-0142)与免疫组化染色孵育盒均为美国Maxin公司产品(购自福州迈新生物技术公司)，染色设对照组，以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。细胞核呈现清晰的棕黄色颗粒为阳性，按阳性细胞所占的比例及显色深度分为：①阴性(-)：阳性细胞数<10％(如图1)；②弱阳性(+)：阳性细胞数10％—25％，显色浅，颗粒细；③中度阳性(++)：阳性细胞数26％—50％，显色较深(如图2)；④强阳性(+++)：阳性细胞数>50％，显色深，颗粒粗。
4.统计学处理 采用χ2检验，P<0.05为有显著性差异。
结果
1.P53表达与Dukes分期的相关性 52例大肠癌标本中P53蛋白表达阳性38例，阳性率73.08％。按Dukes分期分类，A、B期共19例，P53阳性表达10例，阳性率52.63％，C、D期共33例，P53阳性表达28例，阳性率84.85％，P53在C、D期的阳性表达显著高于A、B期(P<0.05)，见表1。
2.P53表达与淋巴转移的相关性 本组发生淋巴结转移49例，其中P53阳性表达46例，阳性率93.88％，无淋巴结转移3例，其中P53阳性表达1例，阳性率33.33％，有淋巴结转移者的阳性表达显著高于无转移者(P<0.05)，见表2。
3.P53表达与肝转移的相关性 完成2年随访的46例患者，B超或CT检查发现其中有肝转移者21例，其大肠癌标本中P53蛋白表达阳性19例，阳性率90.48％，检查未发现肝转移25例，其大肠癌标本中P53蛋白表达阳性15例，阳性率60.00％，有肝转移者的阳性表达显著高于无转移者(P<0.05)，见表3。
讨论
人类P53基因定位于17号染色体短臂1区3.1带(17 P 13.1)，是一个非常重要的抑癌基因，全长16—20 kb，基因组有11个外显子，10个内含子。P53基因分为野生型(wtp53)和突变型(mtp53)。wtp53的抗肿瘤作用主要阻止细胞于G1／GO期，使细胞不能进入S期，从而抑制细胞增殖，诱发细胞凋亡。P53基因大约有50％［3］的突变率，当P53基因发生突变时，可导致稳定的蛋白质不能完成抑制细胞增殖的作用，并且促进细胞恶性转化，侵袭力增强，使P53基因由抑癌基因转为原癌基因。有学者统计结肠癌中P53蛋白阳性率为71.7％［4］，本组病例为73.08％，较之稍高，可能与本组病例以Dukes C、D期为主有关。通过对P53蛋白表达与Dukes分期相关性分析，发现蛋白P53在C、D期的阳性表达显著高于A、B期(P<0.05)，与袁家宾等［5］报道大肠癌中P53表达情况相同，提示P53基因突变可能在结肠癌的发生、发展中起重要作用。有学者［6］研究证实，P53蛋白表达也与肿瘤的分化程度有关，恶性细胞与形态正常的细胞群间的差别十分明显，在低分化增殖区内的细胞核染色鲜明，颗粒粗，与高分化肿瘤细胞存在显著性差异。P53蛋白表达在有肿瘤细胞侵袭淋巴结与无侵袭淋巴结中表达有显著性差异(P<0.05)，提示P53突变在肿瘤细胞侵袭淋巴结及周围组织中起一定的预测作用，可用于结肠癌临床分期。本实验对完成2年随访病例标本中P53蛋白表达率进行统计，发现发生肝转移者中P53阳性表达率为90.48％，无肝转移者中P53阳性表达率60.00％，两者之间有显著性差异(P<0.05)，预示P53阳性表达的结肠癌患者较阴性者发生肝转移可能性大。Porter PL［7］于1992年报道P53基因突变减弱了对癌细胞增殖的抑制作用，易于癌细胞浸润及转移，本组观察结果与之相一致。结肠癌肝转移的发生主要是通过门静脉、肝动脉等回流所致，其中肿瘤新生血管的形成极其重要，钟世顺等［8］通过检测结肠癌不同区域MVD、VEGF和P53蛋白表达，提出在结肠癌血管生成过程中可能存在P53-VEGF调节旁路，P53蛋白表达能促进肿瘤血管的增生。在结肠癌肝转移中，P53基因突变可能存在相似作用，与VEGF等联合促进肝转移灶中肿瘤微血管的形成。
结肠癌肝转移早期诊断的有效检测指标较少，CEA、 CA19-9 c-erbB-2等在临床上应用较多，但缺乏一定的特异性。本组病例通过采用免疫组化Elivision法，对52例结肠癌标本进行了P53蛋白表达的检测，提示其与结肠癌Dukes分期、淋巴结转移及肝转移有关联，对大肠癌早期肝转移有一定的预测作用。但本组样本例数较少，中、晚期病例为多，且随访年限较短，P53的阳性表达对早期肝转移的特异性以及能否和其他检测指标联合运用预测结肠癌肝转移有待进一步观察。
本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
【关键词】 P53；结肠癌肝转移；预测
文章编号：1003-1383(2007)02-0122-03
中图分类号：R 735.35 文献标识码：A
结肠癌是我国较常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居第5位，在消化道恶性肿瘤中居第3位。其中结肠癌合并肝转移相当常见,15%—25%的结直肠癌患者在原发肿瘤诊断时即有肝转移,20%左右的患者在原发肿瘤治疗后随访期出现肝转移［1］,20%—35%的患者表现出肝脏为唯一转移部位［2］。目前在结肠癌肝转移早期尚无有效检测措施，寻找预测结肠癌肝转移的指标对指导临床治疗、提高结肠癌患者的预后具有重要意义。我们应用免疫组化，检测52例结肠癌组织及淋巴结中P53的表达，并且对随访满2年的患者进行P53表达的重新统计，探讨P53的表达与结肠癌发展、结肠癌肝转移之间的关系。
材料与方法
1.材料 收集我院2002年4月—2004年5月期间手术切除原发性结肠癌标本52例，所有病例术前均未行化疗、放疗或免疫治疗，术前肝功能Child分期均为A期，术前B超或CT、术中探查均未提示肝转移，术后结肠癌均经病理证实。52例中男性36例，女性16例，年龄38—72岁，平均年龄50.5岁。到2006年6月止，52例随访中完成随访46例，失访6例，随访率88.46％，随访期间患者均实行5-FU/CF联合化疗。
2.方法 52例新鲜标本用10％福尔马林常规固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，载玻片经多聚-L-赖氨酸防脱片处理。①石蜡切片80℃烤片30 min。②组织切片脱蜡，梯度酒精脱水：放入二甲苯15 min×3次，放入100%乙醇×2次，95％乙醇×2次，80％乙醇×1次，流水冲洗5 min。③抗原修复：0.1 mol/L枸橼酸缓冲液pH 6.0。操作步骤：电饭煲于耐高温塑料切片架上，放入盛有酸缓冲液的耐高温容器皿内，再放入电饭煲中煮10 min，拔去电源插头，保温20 min，取出后冷却至室温。④蒸馏水洗，磷酸缓冲液(PBS)洗，3 min×2次。⑤滴加一抗50—80 μl/张切片，湿盒孵育，4℃冰箱过夜。⑥次日晨，PBS洗3遍，滴加二抗59—80 μl/张切片，湿盒孵育，室温l h左右。⑦PBS洗3遍，滴加100 μl新鲜配制的DAB显色3—10 min。⑧自来水冲洗，苏木精复染15 s，盐酸乙醇分化3 s，温水兰化，梯度乙醇脱水，80％乙醇→乙醇95％→纯乙醇，吹干，中性树胶封固。⑨镜检。
3.阳性结果判断 免疫组化染色采用Elivision法，鼠抗人单克隆抗体P53(MAB-0142)与免疫组化染色孵育盒均为美国Maxin公司产品(购自福州迈新生物技术公司)，染色设对照组，以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。细胞核呈现清晰的棕黄色颗粒为阳性，按阳性细胞所占的比例及显色深度分为：①阴性(-)：阳性细胞数<10％(如图1)；②弱阳性(+)：阳性细胞数10％—25％，显色浅，颗粒细；③中度阳性(++)：阳性细胞数26％—50％，显色较深(如图2)；④强阳性(+++)：阳性细胞数>50％，显色深，颗粒粗。
4.统计学处理 采用χ2检验，P<0.05为有显著性差异。
结果
1.P53表达与Dukes分期的相关性 52例大肠癌标本中P53蛋白表达阳性38例，阳性率73.08％。按Dukes分期分类，A、B期共19例，P53阳性表达10例，阳性率52.63％，C、D期共33例，P53阳性表达28例，阳性率84.85％，P53在C、D期的阳性表达显著高于A、B期(P<0.05)，见表1。
2.P53表达与淋巴转移的相关性 本组发生淋巴结转移49例，其中P53阳性表达46例，阳性率93.88％，无淋巴结转移3例，其中P53阳性表达1例，阳性率33.33％，有淋巴结转移者的阳性表达显著高于无转移者(P<0.05)，见表2。
3.P53表达与肝转移的相关性 完成2年随访的46例患者，B超或CT检查发现其中有肝转移者21例，其大肠癌标本中P53蛋白表达阳性19例，阳性率90.48％，检查未发现肝转移25例，其大肠癌标本中P53蛋白表达阳性15例，阳性率60.00％，有肝转移者的阳性表达显著高于无转移者(P<0.05)，见表3。
讨论
人类P53基因定位于17号染色体短臂1区3.1带(17 P 13.1)，是一个非常重要的抑癌基因，全长16—20 kb，基因组有11个外显子，10个内含子。P53基因分为野生型(wtp53)和突变型(mtp53)。wtp53的抗肿瘤作用主要阻止细胞于G1／GO期，使细胞不能进入S期，从而抑制细胞增殖，诱发细胞凋亡。P53基因大约有50％［3］的突变率，当P53基因发生突变时，可导致稳定的蛋白质不能完成抑制细胞增殖的作用，并且促进细胞恶性转化，侵袭力增强，使P53基因由抑癌基因转为原癌基因。有学者统计结肠癌中P53蛋白阳性率为71.7％［4］，本组病例为73.08％，较之稍高，可能与本组病例以Dukes C、D期为主有关。通过对P53蛋白表达与Dukes分期相关性分析，发现蛋白P53在C、D期的阳性表达显著高于A、B期(P<0.05)，与袁家宾等［5］报道大肠癌中P53表达情况相同，提示P53基因突变可能在结肠癌的发生、发展中起重要作用。有学者［6］研究证实，P53蛋白表达也与肿瘤的分化程度有关，恶性细胞与形态正常的细胞群间的差别十分明显，在低分化增殖区内的细胞核染色鲜明，颗粒粗，与高分化肿瘤细胞存在显著性差异。P53蛋白表达在有肿瘤细胞侵袭淋巴结与无侵袭淋巴结中表达有显著性差异(P<0.05)，提示P53突变在肿瘤细胞侵袭淋巴结及周围组织中起一定的预测作用，可用于结肠癌临床分期。本实验对完成2年随访病例标本中P53蛋白表达率进行统计，发现发生肝转移者中P53阳性表达率为90.48％，无肝转移者中P53阳性表达率60.00％，两者之间有显著性差异(P<0.05)，预示P53阳性表达的结肠癌患者较阴性者发生肝转移可能性大。Porter PL［7］于1992年报道P53基因突变减弱了对癌细胞增殖的抑制作用，易于癌细胞浸润及转移，本组观察结果与之相一致。结肠癌肝转移的发生主要是通过门静脉、肝动脉等回流所致，其中肿瘤新生血管的形成极其重要，钟世顺等［8］通过检测结肠癌不同区域MVD、VEGF和P53蛋白表达，提出在结肠癌血管生成过程中可能存在P53-VEGF调节旁路，P53蛋白表达能促进肿瘤血管的增生。在结肠癌肝转移中，P53基因突变可能存在相似作用，与VEGF等联合促进肝转移灶中肿瘤微血管的形成。
结肠癌肝转移早期诊断的有效检测指标较少，CEA、 CA19-9 c-erbB-2等在临床上应用较多，但缺乏一定的特异性。本组病例通过采用免疫组化Elivision法，对52例结肠癌标本进行了P53蛋白表达的检测，提示其与结肠癌Dukes分期、淋巴结转移及肝转移有关联，对大肠癌早期肝转移有一定的预测作用。但本组样本例数较少，中、晚期病例为多，且随访年限较短，P53的阳性表达对早期肝转移的特异性以及能否和其他检测指标联合运用预测结肠癌肝转移有待进一步观察。
本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。