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摘要目的：观察葛根异黄酮治疗去卵巢大鼠骨质疏松的效果。方法：选用健康3月龄SD雌性大鼠50只，随机分为5组：假手术组、模型对照组、低、中、高剂量葛根异黄酮组;假手术组切除卵巢旁脂肪组织，其余各组均切除双侧卵巢，建立去卵巢大鼠动物模型。按25、50、100 mg/kg 3个剂量葛根异黄酮分别给去卵巢大鼠灌胃6个月，第3、6个月测量体重，并于实验结束后处死大鼠，检测血清钙、磷、碱性磷酸酶水平和股骨中心、远心骨密度。
结果：中、高剂量治疗组动物较模型对照组在第3、6个月体重均降低，在第6个月血清钙明显升高，血清磷和碱性磷酸酶水平明显降低。高剂量治疗组动物较模型对照组在第6个月股骨中心和远心骨密度均明显升高。结论：葛根异黄酮长期治疗可升高血清钙水平，降低血清磷和碱性磷酸酶水平，改善骨密度，具有抗骨质疏松的作用。
Abstract ：Object： To observe the effect of Totalisoflavone on osteoporosistreatment inovariectomized rats.Methods： We randomly distributed 50 healthy and female rats with 3-month of age into 5 groups： sham operation group， model control group and Total isoflavonespueraria groups with low， medium and high-dose administration. Thesham group was removed adipose tissuesaroundovarian， the others were all ovariectomizedrats.The ovariectomizedrats were model controls， or were intragastric administrated with Totalisoflavone at the dose of 25， 50 or 100 mg/kg. In the third and sixth month， weights of rats were observed. In the six month， the levels of Ca+， P and alkaline phosphatase （ALP） in serum， and the bone mineral density （BMD） in both center and far-end of femur were tested.Results： The weights of medium and high-dose groups were lower than the model controls in the third and sixth month. Compared with the model controls， the levels of Ca+ in serum were increased， and the levels of P and ALP in serum were decreased in medium and high-dose groups in the sixth months. The BMDs in both center and far-end of femur were higher in high-dose group than the model controls in the sixth months.
Conclusions： Treatment with Totalisoflavone in a long term could increase the level of Ca+ in serum， decrease the level of P and ALP in serum， improve BMD， showing an effect of anti-osteoporosis.
随着人口结构的老龄化，骨质疏松症已成为人类健康关注的热点问题。骨质疏松症是一种系统性骨病，其特征是骨量下降和骨的微细结构破坏， 表现为骨的脆性增加，因而骨折的危险性大为增加。本病常见于老年人，其中绝经人群骨质疏松症发病率高达25%-50%，它的发生与体内雌激素下降有关。近年，应用植物雌激素防治绝经后骨质疏松症已引起了国内外专家的广泛关注。研究表明，植物葛根中异黄酮含量可达8%以上，且提取和纯化十分简便[1]。本研究用去卵巢大鼠作为绝经后骨质疏松动物模型，观察葛根异黄酮在剂量和时间变化上对骨质疏松症的防治效果，为绝经人群骨质疏松症采用新的防治方法提供实验依据。
1. 材料与方法：
1.1材料
3月龄清洁级SD雌性大鼠50只，体重253-291克，由南华大学实验动物中心提供。葛根异黄酮（纯度95.0%），购于湖南省永州四通生物制品有限责任公司;全自动生化分析仪（71 70 型，日本日立株式会社）;DEXA双能X线骨密度仪（美国Lumar公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与处理
清洁级SD雌性成年大鼠50只， 随机分为5组，每组10只。假手术组（只切除卵巢旁脂肪组织）为空白对照;其余40只为切除卵巢组，分别为模型对照组、葛根异黄酮低剂量组（25mg/kg）、中剂量组（50mg/kg）、高剂量组（100mg/kg）。上述大鼠试验期间在相同的实验条件下给予普通饲料。待术后第7～12天，逐只进行阴道细胞学涂片，术后第4周行眼眶采血测血清雌二醇（E2）水平，确定造模是否成功。待造模成功正常喂养1周后，进入干预阶段，按各组设计的葛根异黄酮剂量灌胃，模型对照组灌以生理盐水，每天1次，每周称一次体重，并根据体重调整灌胃剂量，实验周期为6个月。实验第24周末，禁食 24 h， 行颈椎脱臼法处死所有实验大鼠。 处死前收集血液样品，解剖大鼠后采集骨骼样品，检测反映骨变化的相关指标。 1.2.2指标测定
大鼠处死前取血 3-5 ml/ 只，静置后 1000 r/ min 离心 5 min， 用自动生化分析仪测定、血钙、血磷和碱性磷酸酶。处死大鼠后，剥离左侧股骨，用骨密度仪测量大鼠股骨中点及远心端骨密度（BMD）。
1.2.3 统计学处理
所有数据采用SPSS17.0统计软件进行处理，两组之间比较采用t检验，数据均采用均数±标准（x±s）差表示，以P<0.05为差异有显著性。
2. 结果
2.1 葛根异黄酮对去卵巢大鼠体重的影响
实验前各组大鼠的起始体重无明显差异，随实验喂养时间延长均增长，实验第24周末体重增加最多，符合动物自然生长规律。第3个月和第6个月模型对照组体重均高于假手术组（P<0.05）;中、高剂量葛根异黄酮组动物体重与对应时间的模型对照组比较均明显下降（P<0.05）（表1）。
表1. 葛根异黄酮对去卵巢大鼠体重的影响（g，x±s）
注：a：与假手术组比较P<0.05;b：与模型对照组比较P<0.05。
2.2 葛根异黄酮对去卵巢大鼠血清中钙、磷和碱性磷酸酶的影响
如表2所示，实验干预6个月后，假模型组血清中钙较假手术组明显降低，血磷和碱性磷酸酶则明显升高。葛根异黄酮中、高剂量治疗6个月后，去卵巢大鼠血清中钙较模型对照组明显升高，血磷和碱性磷酸酶则明显降低（P均<0.05）。葛根异黄酮低剂量治疗组较模型对照组则无明显变化。
表2.葛根异黄酮对去卵巢大鼠血清中钙、磷和碱性磷酸酶的影响（x±s）
注：a：与假手术组比较P<0.05;b：与模型对照组比较P<0.05。
2.3 葛根异黄酮对去卵巢大鼠股骨骨密度的影响
如表3所示，实验干预6个月后，假模型组股骨中心BMD和股骨远心端BMD均较假手术组明显降低（P<0.05）。葛根异黄酮高剂量组较模型对照组明显升高（P<0.05），但低、中剂量组则无明显改变。
表3.葛根异黄酮对去卵巢大鼠股骨骨密度的影响（x±s）
注：a：与假手术组比较P<0.05;b：与模型对照组比较P<0.05。
3.讨论
本研究发现葛根异黄酮治疗6个月后，不同剂量治疗组的去卵巢大鼠效果不同。其中，中、高剂量组大鼠体重较模型对照组明显降低，血清钙明显升高，血清磷和碱性磷酸酶明显降低;而股骨中心和远端的BMD均在高剂量组明显升高。既往类似研究多以3个月作为葛根异黄酮治疗的终点时间，本研究以6个月作为观察终点，观察不同剂量葛根异黄酮对去卵巢大鼠长期治疗的效果，结果证实中、高剂量葛根异黄酮具有治疗去卵巢大鼠骨质疏松的作用。
去卵巢大鼠体重明显升高，经中、高剂量葛根异黄酮治疗3个月后，体重明显降低，与既往的研究结果一致[2]。并且我们进一步发现，经过6个月治疗后，去卵巢大鼠血钙含量较模型对照组降低，并且血磷含量升高，说明发生了骨矿化降低，骨生物学性能下降，骨脆性增加，易于发生骨折等并发症。同时，去卵巢大鼠雌激素水平下降，继而引起血清碱性磷酸酶活性增加，提示成骨细胞活跃，骨骼处于高转换状态。经葛根异黄酮的6个月治疗后，血清钙明显升高，血清磷和碱性磷酸酶则明显降低，并且需达到中等剂量以上才见明显效果。该结果提示，葛根异黄酮能明显缓解由于雌激素撤退导致的骨质疏松表现。另一方面，既往的研究发现，经过3个治疗后，只有高剂量治疗组有明显效果[3]。而本研究发现，经过更长时间的治疗后，中等剂量治疗组也可显示出疗效，提示小剂量长期使用葛根异黄酮可能作为治疗方案进行参考，但仍需进一步的临床研究进行验证。
本研究还发现，股骨中心和远心端BMD经过6个月高剂量葛根异黄酮治疗后，较模型对照组明显升高，提示葛根异黄酮对骨骼的保护作用。BMD是评价骨骼强度最直接的指标 [4]，而骨质疏松本质即为骨骼结构退化，骨强度降低。本研究中，模型对照组BMD较假手术组明显降低，说明雌激素对BMD的保护作用。葛根异黄酮治疗后股骨BMD升高，也提示了葛根异黄酮对于骨骼退化具有雌激素样保护作用。
本研究从动物模型的角度证实了葛根异黄酮对于绝经后骨质疏松症的治疗作用。但对于葛根异黄酮对骨质疏松症治疗的机制及长期使用的副作用，仍需进一步的探讨。
参考文献：
1. Inaba M， Terada M， Nishizawa Y， Shioi A， Ishimura E， Otani S， Morii H. Protective effect of an aldose reductase inhibitor against bone loss in galactose-fed rats： possible involvement of the polyol pathway in bone metabolism.Metabolism. 1999;48（7）：904-9.
2. 罗显禄. 葛根异黄酮对去卵巢大鼠的抗骨质疏松作用及机制. 中国生化药物杂志. 2012;33（3）：262-264.
3. 周艳，扶晓明，王维芬，王友良. 葛根异黄酮对去卵巢大鼠骨骼质量的影响. 微量元素与健康研究. 2012;29（1）：1-3.
4. 谢展雄， 吴健伟， 吴铁松. 衰老模型大鼠脑组织超氧化物酶活性和丙二醛含量的影响. 中国药房. 2009;20;（19）：1459-1460.
结果：中、高剂量治疗组动物较模型对照组在第3、6个月体重均降低，在第6个月血清钙明显升高，血清磷和碱性磷酸酶水平明显降低。高剂量治疗组动物较模型对照组在第6个月股骨中心和远心骨密度均明显升高。结论：葛根异黄酮长期治疗可升高血清钙水平，降低血清磷和碱性磷酸酶水平，改善骨密度，具有抗骨质疏松的作用。
Abstract ：Object： To observe the effect of Totalisoflavone on osteoporosistreatment inovariectomized rats.Methods： We randomly distributed 50 healthy and female rats with 3-month of age into 5 groups： sham operation group， model control group and Total isoflavonespueraria groups with low， medium and high-dose administration. Thesham group was removed adipose tissuesaroundovarian， the others were all ovariectomizedrats.The ovariectomizedrats were model controls， or were intragastric administrated with Totalisoflavone at the dose of 25， 50 or 100 mg/kg. In the third and sixth month， weights of rats were observed. In the six month， the levels of Ca+， P and alkaline phosphatase （ALP） in serum， and the bone mineral density （BMD） in both center and far-end of femur were tested.Results： The weights of medium and high-dose groups were lower than the model controls in the third and sixth month. Compared with the model controls， the levels of Ca+ in serum were increased， and the levels of P and ALP in serum were decreased in medium and high-dose groups in the sixth months. The BMDs in both center and far-end of femur were higher in high-dose group than the model controls in the sixth months.
Conclusions： Treatment with Totalisoflavone in a long term could increase the level of Ca+ in serum， decrease the level of P and ALP in serum， improve BMD， showing an effect of anti-osteoporosis.
随着人口结构的老龄化，骨质疏松症已成为人类健康关注的热点问题。骨质疏松症是一种系统性骨病，其特征是骨量下降和骨的微细结构破坏， 表现为骨的脆性增加，因而骨折的危险性大为增加。本病常见于老年人，其中绝经人群骨质疏松症发病率高达25%-50%，它的发生与体内雌激素下降有关。近年，应用植物雌激素防治绝经后骨质疏松症已引起了国内外专家的广泛关注。研究表明，植物葛根中异黄酮含量可达8%以上，且提取和纯化十分简便[1]。本研究用去卵巢大鼠作为绝经后骨质疏松动物模型，观察葛根异黄酮在剂量和时间变化上对骨质疏松症的防治效果，为绝经人群骨质疏松症采用新的防治方法提供实验依据。
1. 材料与方法：
1.1材料
3月龄清洁级SD雌性大鼠50只，体重253-291克，由南华大学实验动物中心提供。葛根异黄酮（纯度95.0%），购于湖南省永州四通生物制品有限责任公司;全自动生化分析仪（71 70 型，日本日立株式会社）;DEXA双能X线骨密度仪（美国Lumar公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与处理
清洁级SD雌性成年大鼠50只， 随机分为5组，每组10只。假手术组（只切除卵巢旁脂肪组织）为空白对照;其余40只为切除卵巢组，分别为模型对照组、葛根异黄酮低剂量组（25mg/kg）、中剂量组（50mg/kg）、高剂量组（100mg/kg）。上述大鼠试验期间在相同的实验条件下给予普通饲料。待术后第7～12天，逐只进行阴道细胞学涂片，术后第4周行眼眶采血测血清雌二醇（E2）水平，确定造模是否成功。待造模成功正常喂养1周后，进入干预阶段，按各组设计的葛根异黄酮剂量灌胃，模型对照组灌以生理盐水，每天1次，每周称一次体重，并根据体重调整灌胃剂量，实验周期为6个月。实验第24周末，禁食 24 h， 行颈椎脱臼法处死所有实验大鼠。 处死前收集血液样品，解剖大鼠后采集骨骼样品，检测反映骨变化的相关指标。 1.2.2指标测定
大鼠处死前取血 3-5 ml/ 只，静置后 1000 r/ min 离心 5 min， 用自动生化分析仪测定、血钙、血磷和碱性磷酸酶。处死大鼠后，剥离左侧股骨，用骨密度仪测量大鼠股骨中点及远心端骨密度（BMD）。
1.2.3 统计学处理
所有数据采用SPSS17.0统计软件进行处理，两组之间比较采用t检验，数据均采用均数±标准（x±s）差表示，以P<0.05为差异有显著性。
2. 结果
2.1 葛根异黄酮对去卵巢大鼠体重的影响
实验前各组大鼠的起始体重无明显差异，随实验喂养时间延长均增长，实验第24周末体重增加最多，符合动物自然生长规律。第3个月和第6个月模型对照组体重均高于假手术组（P<0.05）;中、高剂量葛根异黄酮组动物体重与对应时间的模型对照组比较均明显下降（P<0.05）（表1）。
表1. 葛根异黄酮对去卵巢大鼠体重的影响（g，x±s）
注：a：与假手术组比较P<0.05;b：与模型对照组比较P<0.05。
2.2 葛根异黄酮对去卵巢大鼠血清中钙、磷和碱性磷酸酶的影响
如表2所示，实验干预6个月后，假模型组血清中钙较假手术组明显降低，血磷和碱性磷酸酶则明显升高。葛根异黄酮中、高剂量治疗6个月后，去卵巢大鼠血清中钙较模型对照组明显升高，血磷和碱性磷酸酶则明显降低（P均<0.05）。葛根异黄酮低剂量治疗组较模型对照组则无明显变化。
表2.葛根异黄酮对去卵巢大鼠血清中钙、磷和碱性磷酸酶的影响（x±s）
注：a：与假手术组比较P<0.05;b：与模型对照组比较P<0.05。
2.3 葛根异黄酮对去卵巢大鼠股骨骨密度的影响
如表3所示，实验干预6个月后，假模型组股骨中心BMD和股骨远心端BMD均较假手术组明显降低（P<0.05）。葛根异黄酮高剂量组较模型对照组明显升高（P<0.05），但低、中剂量组则无明显改变。
表3.葛根异黄酮对去卵巢大鼠股骨骨密度的影响（x±s）
注：a：与假手术组比较P<0.05;b：与模型对照组比较P<0.05。
3.讨论
本研究发现葛根异黄酮治疗6个月后，不同剂量治疗组的去卵巢大鼠效果不同。其中，中、高剂量组大鼠体重较模型对照组明显降低，血清钙明显升高，血清磷和碱性磷酸酶明显降低;而股骨中心和远端的BMD均在高剂量组明显升高。既往类似研究多以3个月作为葛根异黄酮治疗的终点时间，本研究以6个月作为观察终点，观察不同剂量葛根异黄酮对去卵巢大鼠长期治疗的效果，结果证实中、高剂量葛根异黄酮具有治疗去卵巢大鼠骨质疏松的作用。
去卵巢大鼠体重明显升高，经中、高剂量葛根异黄酮治疗3个月后，体重明显降低，与既往的研究结果一致[2]。并且我们进一步发现，经过6个月治疗后，去卵巢大鼠血钙含量较模型对照组降低，并且血磷含量升高，说明发生了骨矿化降低，骨生物学性能下降，骨脆性增加，易于发生骨折等并发症。同时，去卵巢大鼠雌激素水平下降，继而引起血清碱性磷酸酶活性增加，提示成骨细胞活跃，骨骼处于高转换状态。经葛根异黄酮的6个月治疗后，血清钙明显升高，血清磷和碱性磷酸酶则明显降低，并且需达到中等剂量以上才见明显效果。该结果提示，葛根异黄酮能明显缓解由于雌激素撤退导致的骨质疏松表现。另一方面，既往的研究发现，经过3个治疗后，只有高剂量治疗组有明显效果[3]。而本研究发现，经过更长时间的治疗后，中等剂量治疗组也可显示出疗效，提示小剂量长期使用葛根异黄酮可能作为治疗方案进行参考，但仍需进一步的临床研究进行验证。
本研究还发现，股骨中心和远心端BMD经过6个月高剂量葛根异黄酮治疗后，较模型对照组明显升高，提示葛根异黄酮对骨骼的保护作用。BMD是评价骨骼强度最直接的指标 [4]，而骨质疏松本质即为骨骼结构退化，骨强度降低。本研究中，模型对照组BMD较假手术组明显降低，说明雌激素对BMD的保护作用。葛根异黄酮治疗后股骨BMD升高，也提示了葛根异黄酮对于骨骼退化具有雌激素样保护作用。
本研究从动物模型的角度证实了葛根异黄酮对于绝经后骨质疏松症的治疗作用。但对于葛根异黄酮对骨质疏松症治疗的机制及长期使用的副作用，仍需进一步的探讨。
参考文献：
1. Inaba M， Terada M， Nishizawa Y， Shioi A， Ishimura E， Otani S， Morii H. Protective effect of an aldose reductase inhibitor against bone loss in galactose-fed rats： possible involvement of the polyol pathway in bone metabolism.Metabolism. 1999;48（7）：904-9.
2. 罗显禄. 葛根异黄酮对去卵巢大鼠的抗骨质疏松作用及机制. 中国生化药物杂志. 2012;33（3）：262-264.
3. 周艳，扶晓明，王维芬，王友良. 葛根异黄酮对去卵巢大鼠骨骼质量的影响. 微量元素与健康研究. 2012;29（1）：1-3.
4. 谢展雄， 吴健伟， 吴铁松. 衰老模型大鼠脑组织超氧化物酶活性和丙二醛含量的影响. 中国药房. 2009;20;（19）：1459-1460.