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论文摘要：以阿司匹林为药物模型，制备阿司匹林磁性壳聚糖微球（AMCM），研究其体外释放度与体内靶向性。
主题词： 阿司匹林 制备
中图分类号：TQ426.62
一、材料与方法
1、材料
试剂 阿司匹林原料药（桂林制药厂），阿司匹林对照品（中国药品生物制品检定所），壳聚糖（自制，脱乙酰度为82.1%），Fe3O4（AR，上海大场场南化工厂），25%戊二醛水溶液（生化试剂BR，中国医药集团上海化学试剂公司），凝结液（含氢氧化钠质量分数10%，乙醇质量分数2%），氢氧化钠、冰乙酸、无水乙醇、磷酸盐缓冲液（pH 7.4）等均为分析纯产品。酚酞指示剂（上海化学试剂公司分装厂），SnCl2？H2O（美国Sigma公司）。
动物 健康大耳纯种白兔（福清卫生学校实验动物中心）。
仪器 电热恒温干燥箱（SC202型，浙江省嘉兴县新塍电热仪器厂），离心机（800B，上海安亭科学仪器厂），电动搅拌器（JJ1型，常州国华电器有限公司），电热恒温水浴锅（HHS，上海医疗器械五厂），紫外分光光度计（751G，上海分析仪器厂）。永磁铁（Ф6×3.5，中南工业大学粉末冶金研究所）。发射式计算机处理断层摄影（ECT，德国Simons公司）。
2 、 方法
制备AMCM 参照文献[6]。壳聚糖1.000 g溶解于1%醋酸溶液100 mL，连续搅拌至完全溶解，得壳聚糖溶液。精密称取Fe3O4微粉0.100 g，缓慢加入到200 r/min的壳聚糖溶液100 mL中，连续搅拌5 h，混合吸附均匀。取凝结液350 mL，用40 mL注射器吸取含Fe3O4微粉的壳聚糖溶液混匀物，在持续搅拌下缓慢滴入凝结液，继续搅拌30 min。静置36 h后减压抽滤，用无水乙醇洗涤至中性，置恒温干燥箱40 ℃烘干，称取3.95 g。称取上述制备的磁性壳聚糖微球2.000 g用1%醋酸溶液200 mL搅拌溶解，形成A液。取阿司匹林1.50 g用无水乙醇50 mL搅拌溶解，形成B液。将B液缓慢匀速滴入A液中，剧烈搅拌10 min，形成C液。在C液中滴加25%戊二醛水溶液25 mL，交联固化12 h后，用离心2 000 r/min×3 min，将沉淀物重新洗涤3次，40 ℃烘干12 h，得AMCM 1.34 g。60Co灭菌，且将离心液和洗涤液收集合并，得“合并液”。
2）测定载药率和包封率 用0.100 mol/L NaOH溶液滴定“合并液”的阿司匹林残余量，酚酞为指示剂，NaOH 1 mL相当于阿司匹林18.02 mg。按下列公式计算阿司匹林磁性壳聚糖微球的载药率和包封率：
载药率=（投药量合并液中药量）/微球重量×100%
包封率=（投药量合并液中药量）/投药量×100%
3） 测定AMCM体外释药
建立阿司匹林标准液标准曲线 精密称取阿司匹林0.025 g，溶于无水乙醇，并定容于100 mL容量瓶，振荡摇匀后分别精确移取0，1，2，3，4，5 mL分置于50 mL容量瓶，加蒸馏水稀释至刻度，测定光密度[D（280 nm）]，以D为纵坐标，以浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：
A=0.00348C+0.0598（C，μg/mL） r=0.998
测定AMCM体外缓释 采用动态透析法测定，精密称取AMCM 0.500 g置于透析袋内，加入pH 7.40的磷酸盐缓冲溶液500 mL，置于（37±0.5）℃恒温水浴，连续搅拌24 h，转速为100 r/min，每隔4 h取样液10 mL，每次取样液后即用pH 7.40磷酸盐缓冲溶液补充。分别将取出的悬浮液在2000 r/min离心3 min，移取上层清液1 mL定容稀释至50 mL，测定D（280 nm），通过1.2.3.1回归方程计算各时间段阿司匹林浓度。
4） AMCM的99mTc标记 称取AMCM 100 mg，依次加入7.4×108Bq（20 mCi）99mTcO4新鲜淋洗液2 mL和SnCl2溶液（30 μg/mL）100 μL（作为还原剂），室温下振动10 min。离心去上清液，用生理盐水洗涤游离的99mTcO4，离心，去除上清液，如此重复3次，测定同位素标记率。每隔1 h以生理盐水洗涤AMCM，去上清液后测定99mTc含量，观察99mTc标记物衰减情况。
5）AMCM在兔体内分布实验 （1）磁场组与未加磁场组。取兔12只，分2组，戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉，磁场组以AMCM 100 mg溶于生理盐水2 mL，兔耳缘静脉缓慢注射，并在兔头部加磁场（0.25 T）30 min，未加磁场组注射同样药物，但不加磁场。ECT全身摄像并计99mTc标记放射性活度在体内分布情况。（2）不同磁通量组。取兔12只，分2组，戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉，AMCM 100 mg溶于生理盐水2 mL，兔耳缘静脉缓慢注射，在兔头部加磁场，磁通量密度分别为0.25和125 T，30 min后以ECT摄像并计数，观察体内各器官放射性活度分布情况。
二、 结果
1 、 AMCM的外形特征 取上述AMCM 10 mg混悬于生理盐水1 mL中，于光镜及扫描电镜下观察形态结构，测量1个视野中微球直径范围。AMCM呈球形，表面光滑，大小均匀，在生理盐水中分散性好，粒径1～8 μm。
2 、 AMCM的载药率与包封率 记录消耗碱液的体积为14.67 mL。经1.2.2公式计算，AMCM载药率0.922 g/g，包封率82.4%。
3 、 AMCM体外释药测定
AMCM的释放行为 AMCM在起始4 h内释药量20.4%，8 h内48.4%，24 h内总释药量80.3%，本研究制得的磁性微球具有较好的缓释性。
.4、 AMCM在兔体内分布 99mTc标记率为40%，半衰期6 h。各组注射药物后生命征平稳，无异常反应。未加磁场时放射性活度主要聚集在肝脏，加磁场后头部（靶部位）的放射性活度分布是未加磁场的11倍。头部外加0.25 T磁场组30 min后，放射性活度分布是外加磁场0.125 T的7.5倍，显示外加磁通量密度越大，靶部位的放射性活度越高。
三、讨论
1 、AMCM具有体外缓释性 AMCM的释药行为在8 h内是因为起始微球表面吸附的药物溶解及扩散则形成释药的突释效应，而在8 h后由于已进入微球的药物在溶剂作用下溶解，须经壳聚糖包裹材料的空隙再扩散到介质中，使药物均匀缓慢地释放。1～24 h能缓慢释放，释药模式拟合符合Higuichi方程，说明笔者制作的AMCM具有体外缓释性能。有关此微球的体内药代动力学有待进一步研究，以证明其体内的缓释性。
2 、 AMCM具有体内靶向性 经外加磁场作用下的AMCM有较好的靶向分布性，且与外加磁场作用的磁通量密度正相关，提示在不导致动物或人体生理功能紊乱的前提下，为达到满意的作用效果，可适当加大磁通量密度。笔者选择兔头部作为磁控给药的靶向，因为兔头部血循环丰富，可模拟脑血栓靶向给药后磁性微球在病灶内及机体其他部位的分布情况。实验表明加磁场时，微球主要集中在靶部位（头部），而不加磁场时微球主要集中在肝脏，证明99mTc与AMCM紧密结合，外加磁场能改变其体内分布。同时也说明AMCM具有被动靶向于肝脏。这可能由于RES系统的吞噬作用所致，这样难以实现其他组织的靶向给药。本研究表明，通过改善药物磁性的表面性质可以抑制RES系统对其的吞噬作用，减少肝脏的被动靶向，这为磁性微球的主动靶向的实现提供了保证。本实验未做AMCM体内毒性试验，但实验中动物生命征无明显变化，在短期（1个月内）均未死亡。
AMCM有可能成为理想的剂型，笔者推测它将在脑血栓的防治中具有一定的应用价值。
主题词： 阿司匹林 制备
中图分类号：TQ426.62
一、材料与方法
1、材料
试剂 阿司匹林原料药（桂林制药厂），阿司匹林对照品（中国药品生物制品检定所），壳聚糖（自制，脱乙酰度为82.1%），Fe3O4（AR，上海大场场南化工厂），25%戊二醛水溶液（生化试剂BR，中国医药集团上海化学试剂公司），凝结液（含氢氧化钠质量分数10%，乙醇质量分数2%），氢氧化钠、冰乙酸、无水乙醇、磷酸盐缓冲液（pH 7.4）等均为分析纯产品。酚酞指示剂（上海化学试剂公司分装厂），SnCl2？H2O（美国Sigma公司）。
动物 健康大耳纯种白兔（福清卫生学校实验动物中心）。
仪器 电热恒温干燥箱（SC202型，浙江省嘉兴县新塍电热仪器厂），离心机（800B，上海安亭科学仪器厂），电动搅拌器（JJ1型，常州国华电器有限公司），电热恒温水浴锅（HHS，上海医疗器械五厂），紫外分光光度计（751G，上海分析仪器厂）。永磁铁（Ф6×3.5，中南工业大学粉末冶金研究所）。发射式计算机处理断层摄影（ECT，德国Simons公司）。
2 、 方法
制备AMCM 参照文献[6]。壳聚糖1.000 g溶解于1%醋酸溶液100 mL，连续搅拌至完全溶解，得壳聚糖溶液。精密称取Fe3O4微粉0.100 g，缓慢加入到200 r/min的壳聚糖溶液100 mL中，连续搅拌5 h，混合吸附均匀。取凝结液350 mL，用40 mL注射器吸取含Fe3O4微粉的壳聚糖溶液混匀物，在持续搅拌下缓慢滴入凝结液，继续搅拌30 min。静置36 h后减压抽滤，用无水乙醇洗涤至中性，置恒温干燥箱40 ℃烘干，称取3.95 g。称取上述制备的磁性壳聚糖微球2.000 g用1%醋酸溶液200 mL搅拌溶解，形成A液。取阿司匹林1.50 g用无水乙醇50 mL搅拌溶解，形成B液。将B液缓慢匀速滴入A液中，剧烈搅拌10 min，形成C液。在C液中滴加25%戊二醛水溶液25 mL，交联固化12 h后，用离心2 000 r/min×3 min，将沉淀物重新洗涤3次，40 ℃烘干12 h，得AMCM 1.34 g。60Co灭菌，且将离心液和洗涤液收集合并，得“合并液”。
2）测定载药率和包封率 用0.100 mol/L NaOH溶液滴定“合并液”的阿司匹林残余量，酚酞为指示剂，NaOH 1 mL相当于阿司匹林18.02 mg。按下列公式计算阿司匹林磁性壳聚糖微球的载药率和包封率：
载药率=（投药量合并液中药量）/微球重量×100%
包封率=（投药量合并液中药量）/投药量×100%
3） 测定AMCM体外释药
建立阿司匹林标准液标准曲线 精密称取阿司匹林0.025 g，溶于无水乙醇，并定容于100 mL容量瓶，振荡摇匀后分别精确移取0，1，2，3，4，5 mL分置于50 mL容量瓶，加蒸馏水稀释至刻度，测定光密度[D（280 nm）]，以D为纵坐标，以浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：
A=0.00348C+0.0598（C，μg/mL） r=0.998
测定AMCM体外缓释 采用动态透析法测定，精密称取AMCM 0.500 g置于透析袋内，加入pH 7.40的磷酸盐缓冲溶液500 mL，置于（37±0.5）℃恒温水浴，连续搅拌24 h，转速为100 r/min，每隔4 h取样液10 mL，每次取样液后即用pH 7.40磷酸盐缓冲溶液补充。分别将取出的悬浮液在2000 r/min离心3 min，移取上层清液1 mL定容稀释至50 mL，测定D（280 nm），通过1.2.3.1回归方程计算各时间段阿司匹林浓度。
4） AMCM的99mTc标记 称取AMCM 100 mg，依次加入7.4×108Bq（20 mCi）99mTcO4新鲜淋洗液2 mL和SnCl2溶液（30 μg/mL）100 μL（作为还原剂），室温下振动10 min。离心去上清液，用生理盐水洗涤游离的99mTcO4，离心，去除上清液，如此重复3次，测定同位素标记率。每隔1 h以生理盐水洗涤AMCM，去上清液后测定99mTc含量，观察99mTc标记物衰减情况。
5）AMCM在兔体内分布实验 （1）磁场组与未加磁场组。取兔12只，分2组，戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉，磁场组以AMCM 100 mg溶于生理盐水2 mL，兔耳缘静脉缓慢注射，并在兔头部加磁场（0.25 T）30 min，未加磁场组注射同样药物，但不加磁场。ECT全身摄像并计99mTc标记放射性活度在体内分布情况。（2）不同磁通量组。取兔12只，分2组，戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉，AMCM 100 mg溶于生理盐水2 mL，兔耳缘静脉缓慢注射，在兔头部加磁场，磁通量密度分别为0.25和125 T，30 min后以ECT摄像并计数，观察体内各器官放射性活度分布情况。
二、 结果
1 、 AMCM的外形特征 取上述AMCM 10 mg混悬于生理盐水1 mL中，于光镜及扫描电镜下观察形态结构，测量1个视野中微球直径范围。AMCM呈球形，表面光滑，大小均匀，在生理盐水中分散性好，粒径1～8 μm。
2 、 AMCM的载药率与包封率 记录消耗碱液的体积为14.67 mL。经1.2.2公式计算，AMCM载药率0.922 g/g，包封率82.4%。
3 、 AMCM体外释药测定
AMCM的释放行为 AMCM在起始4 h内释药量20.4%，8 h内48.4%，24 h内总释药量80.3%，本研究制得的磁性微球具有较好的缓释性。
.4、 AMCM在兔体内分布 99mTc标记率为40%，半衰期6 h。各组注射药物后生命征平稳，无异常反应。未加磁场时放射性活度主要聚集在肝脏，加磁场后头部（靶部位）的放射性活度分布是未加磁场的11倍。头部外加0.25 T磁场组30 min后，放射性活度分布是外加磁场0.125 T的7.5倍，显示外加磁通量密度越大，靶部位的放射性活度越高。
三、讨论
1 、AMCM具有体外缓释性 AMCM的释药行为在8 h内是因为起始微球表面吸附的药物溶解及扩散则形成释药的突释效应，而在8 h后由于已进入微球的药物在溶剂作用下溶解，须经壳聚糖包裹材料的空隙再扩散到介质中，使药物均匀缓慢地释放。1～24 h能缓慢释放，释药模式拟合符合Higuichi方程，说明笔者制作的AMCM具有体外缓释性能。有关此微球的体内药代动力学有待进一步研究，以证明其体内的缓释性。
2 、 AMCM具有体内靶向性 经外加磁场作用下的AMCM有较好的靶向分布性，且与外加磁场作用的磁通量密度正相关，提示在不导致动物或人体生理功能紊乱的前提下，为达到满意的作用效果，可适当加大磁通量密度。笔者选择兔头部作为磁控给药的靶向，因为兔头部血循环丰富，可模拟脑血栓靶向给药后磁性微球在病灶内及机体其他部位的分布情况。实验表明加磁场时，微球主要集中在靶部位（头部），而不加磁场时微球主要集中在肝脏，证明99mTc与AMCM紧密结合，外加磁场能改变其体内分布。同时也说明AMCM具有被动靶向于肝脏。这可能由于RES系统的吞噬作用所致，这样难以实现其他组织的靶向给药。本研究表明，通过改善药物磁性的表面性质可以抑制RES系统对其的吞噬作用，减少肝脏的被动靶向，这为磁性微球的主动靶向的实现提供了保证。本实验未做AMCM体内毒性试验，但实验中动物生命征无明显变化，在短期（1个月内）均未死亡。
AMCM有可能成为理想的剂型，笔者推测它将在脑血栓的防治中具有一定的应用价值。