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【中图分类号】R87 【文献标识码】A 【文章编号】1550-1868（2014）12
【摘要】目的：探讨运动锻炼对糖尿病鼠下肢血管新生相关因子表达的影响，为临床治疗糖尿病足提供新思路。方法：将SD大鼠随机分为运动锻炼组、模型组和假手术组。除假手术组外，其余2组建立大鼠左下肢缺血模型。建模一周后，运动锻炼组大鼠跑步锻炼30 min/d；模型组和假手术组均为日常活动。运动锻炼4周后，取各组大鼠左下肢大腿内收肌组织块，通过免疫组化检测微血管密度（MVD）、血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-1（Ang-1）的表达。结果：运动锻炼组大鼠肌组织VEGF、Ang-1的表达和MVD均高于模型组和假手术组（P < 0.01）。结论：运动锻炼可以促进缺血下肢微血管新生。
【关键词】缺血； 运动锻炼； 血管新生； 微血管密度； 血管内皮生长因子； 血管生成素-1
Expression of angiogenesis-related factors in diabetic rats with exercise
Mei yan1 Hu xiao yan2 Liu yong 3
1.Department of Operation room， Affiliated Hospital of luzhou Medical colledge， 2. Department of Medical Microbiology and Parasitolog， Luzhou Medical College， 3. Department of Vascular Surgery， Affiliated Hospital of luzhou Medical colledge
【Abstract】Objective：to discuss the effect of the expression of angiogenesis-related factors in diabetic rats with exercise training. Methods： 30 health male Sprague-Dawley rats were randomly divided into exercise group（A）， model group（B） and sham surgery group（C）. Hindlimb ischemia was established in group A and B by surgical excision of left femoral arteries.Rats in group A were trained to run 30 minutes once a day ， group B and C just were daily activities. After 4 weeks， killed all rats and obtained MVD、VEGF、Ang-1 in the ischemic tissues by immunohistochemistry and compared the difference between 3 groups. Results： The expression of VEGF and Ang-1 and in group A were higher the other groups （p<0.01）. Conclusion： Exercise can promot angiogenesis of ischemic limb.
【Key Words】 ischemia； exercise； angiogenesis； microvessel density vascular endothelial growth factor ；angiopoietin-1
動脉硬化、糖尿病血管并发症是导致心、脑血管病的主要原因。高出非糖尿病人群2--4倍 [1] 。随着人口老龄化，下肢动脉缺血性疾病发病率逐年增高，临床医生在多节段动脉硬化性闭塞以及广泛小动脉闭塞患者治疗方面迎来了巨大挑战 [1] 。运动锻炼能够改善患者缺血下肢血供，增加无痛行走距离和最大行走距离，进一步提高患者生活质量。目前，在应用血管生长因子及基因疗法促进缺血组织的血管新生达到治疗缺血性疾病方面的研究取得了一定的成绩。研究表明，血管再生因运动锻炼而获益，为缺血性疾病提供了新的治疗思路。本实验在建立大鼠肢体缺血模型基础上，研究运动锻炼对大鼠下肢缺血区血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）表达和毛细血管新生的影响，探讨运动锻炼促进缺血组织血管新生机制，为临床应用运动锻炼治疗下肢慢性缺血提供理论依据。
1.材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
成年健康雄性SD大鼠30只，体重200±20g，鼠龄12周，均由泸州医学院实验动物中心提供。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》 [2] 。
1.1.2 大鼠运动锻炼器
自制滚筒式网状训练器：长1.0m，直径0.5m的圆形网状仪器，底座有一固定架，一端有一手摇柄，以5 r/min手摇转动锻炼器；可锻炼大鼠的抓握、旋转、行走等运动。
1.1.3 试剂和仪器
试剂盒仪器 来源
兔抗鼠VWF因子 美国 Santa Cruz公司
兔抗鼠VEGF，Ang-1多克隆抗体 北京中杉公司
cck-8试剂盒 日本同仁化学研究所 ELSIA试剂盒 大连泛邦化工试剂公司
SABC试剂盒 武汉博士德公司
1.2 实验方法
1.2.1 分组和建模
将30只大鼠随机分为运动锻炼组、模型组和假手术组，10只/组。以体积分数3%戊巴比妥钠（25mg/kg）对运动锻炼组和模型组大鼠进行腹腔推注麻醉后，固定，手术部位消毒。在左侧腹股沟中点至膝部作一长度约2cm的纵行切口，紧贴腹股沟下方分离股动脉主干，并于起始部结扎，游离股浅动脉至膝下并切除，结扎股深动脉等分支血管。止血后缝合包扎。假手术组在相应部位仅作皮肤切开、缝合。
建模成功1周后，每日上午将运动锻炼组大鼠置入网状滚筒运动锻炼器中，顺时针匀速转动（10 r/min），诱导大鼠匀速跑动，至大鼠有疲劳感（以大鼠跑动步伐渐渐跟不上匀速旋转的滚筒为标准）[3] ，约30 min。模型组和假手术组只保持日常活动。
1.2.2 取材与固定
运动锻炼4周后（30 min/d） [4] ，3组大鼠全部深麻醉处死，取左大腿内收肌组织块，大小约1.0 cm × 0.5 cm × 0.5 cm，固定，石蜡包埋，恒温切片机分别沿肌纤维走向及垂直走向切片，捞片，烤片。
1.2.3苏木精-伊红染色
石蜡切片脱蜡，水化后苏木素染液染色，盐酸分化，伊红染液复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。
1.2.4 MVD、VEGF和Ang-1的免疫组化检测
依据链霉素-生物素过氧化物酶复合物法（SABC法）进行免疫组化反应。一抗为兔抗鼠VWF因子（浓缩型），兔抗鼠VEGF多克隆抗体；兔抗鼠Ang-1多克隆抗体。二抗为即用型SABC试剂盒，依说明书进行操作。
以胞浆呈棕黄色染色者为内皮细胞VWF表达阳性，对VWF阳性进行微血管记数，首先在低倍镜下选择着色密度最高的区域，然后在200倍光镜下，随机计数5个视野内微血管数，取平均值作为该片的每视野下的血管数，即微血管密度（microvessel density ，MVD）。以胞浆呈棕黄色染色者为内皮细胞、骨骼肌细胞 VEGF和Ang-1 表达阳性，两名观察者用双盲法于200倍光镜下随机选5个视野，根据染色强度和阳性细胞数计算VEGF和Ang-1评分 [5] 。
1.3 统计学分析
应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x±s 表示，组间比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1实验动物数量分析
纳入大鼠30只均进入结果分析，无死亡及感染，无脱落。
2.2 大鼠左下肢缺血后行为学变化
运动锻炼组和模型组大鼠，术后均出现左下肢跛行等缺血表现。1周后经彩色多普勒检查提示大腿部动脉血流中断，证实模型建立成功。
2.3 大鼠左下肢缺血后组织微血管密度变化
观察运动锻炼组、模型组的骨骼肌细胞间隙，可见断面圆形的细血管，假手术组仅见少许微血管分布。免疫组化切片，运动锻炼组和模型组可见大量新生血管，主要分布在骨骼肌细胞间，血管壁被覆1～数个内皮细胞，VWF表达阳性，表现为胞浆呈棕黄色且运动锻炼组组织MVD明显高于模型组（P < 0.01），运动锻炼组和模型组组织MVD均显著高于假手术组（P < 0.01）。
2.4大鼠左下肢缺血后VEGF、Ang-1表达
运动锻炼组和模型组沿骨骼肌横向切片免疫组化检测后VEGF、Ang-1表达均显示良好：骨骼肌细胞有棕黄色颗粒沉着，棕黄色颗粒呈异质状分布于胞漿内，提示VEGF和Ang-1表达阳性。运动锻炼组VEGF和Ang-1表达明显高于模型组（P < 0.01）。假手术组VEGF和Ang-1为阴性或弱阳性表达，显著低于模型组（P < 0.01）（见表1）。
表1 大鼠肌组织MVD及VEGF、Ang-1表达（x±s ）
组别 MVD（个） VEGF Ang-1
运动锻炼组 39.94±4.01ab 3.30±0.67ab 3.01±0.73ab
模型组 27.23±3.64a 2.29±0.67a 2.19±0.69a
假手术组 3.32±2.26 0.59±0.49 0.77±0.53
a表示与假手术组比较： P < 0.01；b：表示与模型组比较：P < 0.01。
3.讨论
随着我国步入老龄化，动脉硬化性闭塞症患病率日益剧增，增加老龄患者的截肢率，严重影响患者的生活质量。长期慢性缺血肢体自身具有代偿功能，表现为侧支循环建立、促血管新生因子及其受体表达上升，导致血管系统重塑以满足肌肉活动的供氧。近年来国内外研究已认识到由缺血造成的一切病变均可通过侧支循环的建立和血管的新生得到改善。
运动可以提高血流对血管壁的剪切力和促进机体VEGF—R信号的激活，而VEGFR家族有几种亚型，其中VEGFR-2与内皮细胞增殖、分化最为密切相关，外周血中VEGF与VEGFR-2结合后激活信号通路从而诱导内皮细胞增殖和分化，促进成管以及侧支循环形成和毛细血管的新生。本实验发现，肢体缺血大鼠模型经运动锻炼后，缺血组织VEGF和Ang-1表达明显提高，微血管密度增加，说明运动锻炼能促进缺血肢体新血管生成和侧支循环形成，组织供血得到改善。运动能有效提高外周血中VEGE和Ang-1水平。此外，运动还诱导血管代偿性改变，骨骼肌局部血流量增加，毛细血管密度增大；血流对血管壁剪切应力增强，刺激内皮细胞释放各种因子：如一氧化氮，前列腺素，内皮素1，血管紧张素Ⅱ，组织型纤溶酶原激活物，纤溶酶原激活物抑制剂-1，血友病因子，粘附分子，细胞因子（如肿瘤坏死因子-a）等，产生一系列复杂反应。 血管再生是一個极其复杂的过程，涉及内皮细胞分裂、血管基底膜及细胞外基质降解和内皮细胞迁移等；新血管的形成来源于先前存在的血管内皮细胞增殖，而内皮细胞增殖有赖于VEGF的刺激。VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原，其生成由于mRNA的剪切方式不同，可有VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖、迁移和趋化，增加血管通透性能，促进单核巨噬细胞迁移，进而分泌多种血管生长因子，间接促进血管新生 [6] 。VEGF能有效动员骨髓内皮祖细胞入外周血、诱导骨髓内皮祖细胞增殖，并定位到缺血组织，在原位分化形成成熟的内皮细胞，从而形成新的血管 [7] 。研究证实运动是动员骨髓内皮祖细胞的有效手段，同时骨髓内皮祖细胞又能分泌VEGF等促血管生长因子 [8] ，达到治疗血管新生的效果，从多途径促进缺血部位的血管新生。Ang-1是继血管内皮生长因子之后新研究发现的一种促进血管新生的重要生长因子，主要由血管内皮周围组织分泌的糖蛋白，具有趋化、募集内皮细胞及血管周围细胞的作用，并且诱导血管内皮细胞芽生、增殖、迁移和形成管状结构，拮抗血管内皮细胞凋亡，参与维持成熟血管完整性，有效防止微血管渗漏 [9-10] 。有研究表明，Ang-1能够协同VEGF促进血管新生，有效减少炎症反应以及VEGF引起的副反应并使新生血管塑形和成熟 [11] .
本实验表明以跑步为代表的体育运动锻炼能促进组织血管新生，有助于阐明运动锻炼促进下肢血管新生理论，丰富“治疗性血管新生”理论研究以及康复治疗发展。运动锻炼同时能改善机体微循环，减轻患肢组织炎性病变，增强患者心肺功能等，有望在慢性动脉闭塞性疾病的治疗中发挥作用。但该实验样本量较少，只观察到术后28d，对血管内皮生长因子浓度的继续变化等有待进一步研究。
参考文献
[1]Lazarides MK， Georgiadis GS， Papas TT， et al. Diagnostic criteria and treatment of Buerger's disease： a review. Int J Low Extrem Wounds. 2006；5（2）：89-95.
[2]The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.
[3]Lloyd PG， Prior BM， Li H， et al. VEGF receptor antagonism blocks arteriogenesis， but only partially inhibits angiogenesis， in skeletal muscle of exercise-trained rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005；288（2）：H759-768.
[4]曾绩娟，杨博华，朱凌群，等.下肢缺血大鼠模型血管内皮细胞生长因子变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（46）：9076-9079.
[5]Ivan D， Niveiro M， Diwan AH， et al. Analysis of protein tyrosine kinases expression in the melanoma metastases of patients treated with Imatinib Mesylate. J Cutan Pathol. 2006；2（6）：60-61.
[6]Prior BM， Yang HT， Terjung RL. Terjung. What makes vessels grow with exercise training. J Appl Physiol. 2004；97（3）：1119-1128.
[7]Shintani S， Murohara T， Ikeda H， et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circulation. 2001；103（23）：2776-2779.
[8]Rehman J， Li J， Orschell CM， et al. Peripheral blood “endothelial progenitor cells” are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation. 2003；107（8）： 1164-1169.
[9]Kwak HJ， Lee SJ， Lee YH， et al. Angiopoietin-1 inhibits irradiation and mannitolinduced apoptosis in endothelial cells. Circulation， 2000； 101 （19）： 2317-24.
[10]Gamble JR， Drew J， Trezise L， et al. Angiopoietin-1 is an antipermeability and anti-inflammatory agent in vitro and targets cell junctions. Circ Res， 2000； 87（7）：603-7.
[11]Su H， Takagawa J， Huang Y， et al. Additive effect of AAV-mediated angiopoietin-1 and VEGF expression on the therapy of infarcted heart[J]. Int J Cardiol， 2009， 133（2）： 191-7
【摘要】目的：探讨运动锻炼对糖尿病鼠下肢血管新生相关因子表达的影响，为临床治疗糖尿病足提供新思路。方法：将SD大鼠随机分为运动锻炼组、模型组和假手术组。除假手术组外，其余2组建立大鼠左下肢缺血模型。建模一周后，运动锻炼组大鼠跑步锻炼30 min/d；模型组和假手术组均为日常活动。运动锻炼4周后，取各组大鼠左下肢大腿内收肌组织块，通过免疫组化检测微血管密度（MVD）、血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-1（Ang-1）的表达。结果：运动锻炼组大鼠肌组织VEGF、Ang-1的表达和MVD均高于模型组和假手术组（P < 0.01）。结论：运动锻炼可以促进缺血下肢微血管新生。
【关键词】缺血； 运动锻炼； 血管新生； 微血管密度； 血管内皮生长因子； 血管生成素-1
Expression of angiogenesis-related factors in diabetic rats with exercise
Mei yan1 Hu xiao yan2 Liu yong 3
1.Department of Operation room， Affiliated Hospital of luzhou Medical colledge， 2. Department of Medical Microbiology and Parasitolog， Luzhou Medical College， 3. Department of Vascular Surgery， Affiliated Hospital of luzhou Medical colledge
【Abstract】Objective：to discuss the effect of the expression of angiogenesis-related factors in diabetic rats with exercise training. Methods： 30 health male Sprague-Dawley rats were randomly divided into exercise group（A）， model group（B） and sham surgery group（C）. Hindlimb ischemia was established in group A and B by surgical excision of left femoral arteries.Rats in group A were trained to run 30 minutes once a day ， group B and C just were daily activities. After 4 weeks， killed all rats and obtained MVD、VEGF、Ang-1 in the ischemic tissues by immunohistochemistry and compared the difference between 3 groups. Results： The expression of VEGF and Ang-1 and in group A were higher the other groups （p<0.01）. Conclusion： Exercise can promot angiogenesis of ischemic limb.
【Key Words】 ischemia； exercise； angiogenesis； microvessel density vascular endothelial growth factor ；angiopoietin-1
動脉硬化、糖尿病血管并发症是导致心、脑血管病的主要原因。高出非糖尿病人群2--4倍 [1] 。随着人口老龄化，下肢动脉缺血性疾病发病率逐年增高，临床医生在多节段动脉硬化性闭塞以及广泛小动脉闭塞患者治疗方面迎来了巨大挑战 [1] 。运动锻炼能够改善患者缺血下肢血供，增加无痛行走距离和最大行走距离，进一步提高患者生活质量。目前，在应用血管生长因子及基因疗法促进缺血组织的血管新生达到治疗缺血性疾病方面的研究取得了一定的成绩。研究表明，血管再生因运动锻炼而获益，为缺血性疾病提供了新的治疗思路。本实验在建立大鼠肢体缺血模型基础上，研究运动锻炼对大鼠下肢缺血区血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）表达和毛细血管新生的影响，探讨运动锻炼促进缺血组织血管新生机制，为临床应用运动锻炼治疗下肢慢性缺血提供理论依据。
1.材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
成年健康雄性SD大鼠30只，体重200±20g，鼠龄12周，均由泸州医学院实验动物中心提供。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》 [2] 。
1.1.2 大鼠运动锻炼器
自制滚筒式网状训练器：长1.0m，直径0.5m的圆形网状仪器，底座有一固定架，一端有一手摇柄，以5 r/min手摇转动锻炼器；可锻炼大鼠的抓握、旋转、行走等运动。
1.1.3 试剂和仪器
试剂盒仪器 来源
兔抗鼠VWF因子 美国 Santa Cruz公司
兔抗鼠VEGF，Ang-1多克隆抗体 北京中杉公司
cck-8试剂盒 日本同仁化学研究所 ELSIA试剂盒 大连泛邦化工试剂公司
SABC试剂盒 武汉博士德公司
1.2 实验方法
1.2.1 分组和建模
将30只大鼠随机分为运动锻炼组、模型组和假手术组，10只/组。以体积分数3%戊巴比妥钠（25mg/kg）对运动锻炼组和模型组大鼠进行腹腔推注麻醉后，固定，手术部位消毒。在左侧腹股沟中点至膝部作一长度约2cm的纵行切口，紧贴腹股沟下方分离股动脉主干，并于起始部结扎，游离股浅动脉至膝下并切除，结扎股深动脉等分支血管。止血后缝合包扎。假手术组在相应部位仅作皮肤切开、缝合。
建模成功1周后，每日上午将运动锻炼组大鼠置入网状滚筒运动锻炼器中，顺时针匀速转动（10 r/min），诱导大鼠匀速跑动，至大鼠有疲劳感（以大鼠跑动步伐渐渐跟不上匀速旋转的滚筒为标准）[3] ，约30 min。模型组和假手术组只保持日常活动。
1.2.2 取材与固定
运动锻炼4周后（30 min/d） [4] ，3组大鼠全部深麻醉处死，取左大腿内收肌组织块，大小约1.0 cm × 0.5 cm × 0.5 cm，固定，石蜡包埋，恒温切片机分别沿肌纤维走向及垂直走向切片，捞片，烤片。
1.2.3苏木精-伊红染色
石蜡切片脱蜡，水化后苏木素染液染色，盐酸分化，伊红染液复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。
1.2.4 MVD、VEGF和Ang-1的免疫组化检测
依据链霉素-生物素过氧化物酶复合物法（SABC法）进行免疫组化反应。一抗为兔抗鼠VWF因子（浓缩型），兔抗鼠VEGF多克隆抗体；兔抗鼠Ang-1多克隆抗体。二抗为即用型SABC试剂盒，依说明书进行操作。
以胞浆呈棕黄色染色者为内皮细胞VWF表达阳性，对VWF阳性进行微血管记数，首先在低倍镜下选择着色密度最高的区域，然后在200倍光镜下，随机计数5个视野内微血管数，取平均值作为该片的每视野下的血管数，即微血管密度（microvessel density ，MVD）。以胞浆呈棕黄色染色者为内皮细胞、骨骼肌细胞 VEGF和Ang-1 表达阳性，两名观察者用双盲法于200倍光镜下随机选5个视野，根据染色强度和阳性细胞数计算VEGF和Ang-1评分 [5] 。
1.3 统计学分析
应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x±s 表示，组间比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1实验动物数量分析
纳入大鼠30只均进入结果分析，无死亡及感染，无脱落。
2.2 大鼠左下肢缺血后行为学变化
运动锻炼组和模型组大鼠，术后均出现左下肢跛行等缺血表现。1周后经彩色多普勒检查提示大腿部动脉血流中断，证实模型建立成功。
2.3 大鼠左下肢缺血后组织微血管密度变化
观察运动锻炼组、模型组的骨骼肌细胞间隙，可见断面圆形的细血管，假手术组仅见少许微血管分布。免疫组化切片，运动锻炼组和模型组可见大量新生血管，主要分布在骨骼肌细胞间，血管壁被覆1～数个内皮细胞，VWF表达阳性，表现为胞浆呈棕黄色且运动锻炼组组织MVD明显高于模型组（P < 0.01），运动锻炼组和模型组组织MVD均显著高于假手术组（P < 0.01）。
2.4大鼠左下肢缺血后VEGF、Ang-1表达
运动锻炼组和模型组沿骨骼肌横向切片免疫组化检测后VEGF、Ang-1表达均显示良好：骨骼肌细胞有棕黄色颗粒沉着，棕黄色颗粒呈异质状分布于胞漿内，提示VEGF和Ang-1表达阳性。运动锻炼组VEGF和Ang-1表达明显高于模型组（P < 0.01）。假手术组VEGF和Ang-1为阴性或弱阳性表达，显著低于模型组（P < 0.01）（见表1）。
表1 大鼠肌组织MVD及VEGF、Ang-1表达（x±s ）
组别 MVD（个） VEGF Ang-1
运动锻炼组 39.94±4.01ab 3.30±0.67ab 3.01±0.73ab
模型组 27.23±3.64a 2.29±0.67a 2.19±0.69a
假手术组 3.32±2.26 0.59±0.49 0.77±0.53
a表示与假手术组比较： P < 0.01；b：表示与模型组比较：P < 0.01。
3.讨论
随着我国步入老龄化，动脉硬化性闭塞症患病率日益剧增，增加老龄患者的截肢率，严重影响患者的生活质量。长期慢性缺血肢体自身具有代偿功能，表现为侧支循环建立、促血管新生因子及其受体表达上升，导致血管系统重塑以满足肌肉活动的供氧。近年来国内外研究已认识到由缺血造成的一切病变均可通过侧支循环的建立和血管的新生得到改善。
运动可以提高血流对血管壁的剪切力和促进机体VEGF—R信号的激活，而VEGFR家族有几种亚型，其中VEGFR-2与内皮细胞增殖、分化最为密切相关，外周血中VEGF与VEGFR-2结合后激活信号通路从而诱导内皮细胞增殖和分化，促进成管以及侧支循环形成和毛细血管的新生。本实验发现，肢体缺血大鼠模型经运动锻炼后，缺血组织VEGF和Ang-1表达明显提高，微血管密度增加，说明运动锻炼能促进缺血肢体新血管生成和侧支循环形成，组织供血得到改善。运动能有效提高外周血中VEGE和Ang-1水平。此外，运动还诱导血管代偿性改变，骨骼肌局部血流量增加，毛细血管密度增大；血流对血管壁剪切应力增强，刺激内皮细胞释放各种因子：如一氧化氮，前列腺素，内皮素1，血管紧张素Ⅱ，组织型纤溶酶原激活物，纤溶酶原激活物抑制剂-1，血友病因子，粘附分子，细胞因子（如肿瘤坏死因子-a）等，产生一系列复杂反应。 血管再生是一個极其复杂的过程，涉及内皮细胞分裂、血管基底膜及细胞外基质降解和内皮细胞迁移等；新血管的形成来源于先前存在的血管内皮细胞增殖，而内皮细胞增殖有赖于VEGF的刺激。VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原，其生成由于mRNA的剪切方式不同，可有VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖、迁移和趋化，增加血管通透性能，促进单核巨噬细胞迁移，进而分泌多种血管生长因子，间接促进血管新生 [6] 。VEGF能有效动员骨髓内皮祖细胞入外周血、诱导骨髓内皮祖细胞增殖，并定位到缺血组织，在原位分化形成成熟的内皮细胞，从而形成新的血管 [7] 。研究证实运动是动员骨髓内皮祖细胞的有效手段，同时骨髓内皮祖细胞又能分泌VEGF等促血管生长因子 [8] ，达到治疗血管新生的效果，从多途径促进缺血部位的血管新生。Ang-1是继血管内皮生长因子之后新研究发现的一种促进血管新生的重要生长因子，主要由血管内皮周围组织分泌的糖蛋白，具有趋化、募集内皮细胞及血管周围细胞的作用，并且诱导血管内皮细胞芽生、增殖、迁移和形成管状结构，拮抗血管内皮细胞凋亡，参与维持成熟血管完整性，有效防止微血管渗漏 [9-10] 。有研究表明，Ang-1能够协同VEGF促进血管新生，有效减少炎症反应以及VEGF引起的副反应并使新生血管塑形和成熟 [11] .
本实验表明以跑步为代表的体育运动锻炼能促进组织血管新生，有助于阐明运动锻炼促进下肢血管新生理论，丰富“治疗性血管新生”理论研究以及康复治疗发展。运动锻炼同时能改善机体微循环，减轻患肢组织炎性病变，增强患者心肺功能等，有望在慢性动脉闭塞性疾病的治疗中发挥作用。但该实验样本量较少，只观察到术后28d，对血管内皮生长因子浓度的继续变化等有待进一步研究。
参考文献
[1]Lazarides MK， Georgiadis GS， Papas TT， et al. Diagnostic criteria and treatment of Buerger's disease： a review. Int J Low Extrem Wounds. 2006；5（2）：89-95.
[2]The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.
[3]Lloyd PG， Prior BM， Li H， et al. VEGF receptor antagonism blocks arteriogenesis， but only partially inhibits angiogenesis， in skeletal muscle of exercise-trained rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005；288（2）：H759-768.
[4]曾绩娟，杨博华，朱凌群，等.下肢缺血大鼠模型血管内皮细胞生长因子变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（46）：9076-9079.
[5]Ivan D， Niveiro M， Diwan AH， et al. Analysis of protein tyrosine kinases expression in the melanoma metastases of patients treated with Imatinib Mesylate. J Cutan Pathol. 2006；2（6）：60-61.
[6]Prior BM， Yang HT， Terjung RL. Terjung. What makes vessels grow with exercise training. J Appl Physiol. 2004；97（3）：1119-1128.
[7]Shintani S， Murohara T， Ikeda H， et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circulation. 2001；103（23）：2776-2779.
[8]Rehman J， Li J， Orschell CM， et al. Peripheral blood “endothelial progenitor cells” are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation. 2003；107（8）： 1164-1169.
[9]Kwak HJ， Lee SJ， Lee YH， et al. Angiopoietin-1 inhibits irradiation and mannitolinduced apoptosis in endothelial cells. Circulation， 2000； 101 （19）： 2317-24.
[10]Gamble JR， Drew J， Trezise L， et al. Angiopoietin-1 is an antipermeability and anti-inflammatory agent in vitro and targets cell junctions. Circ Res， 2000； 87（7）：603-7.
[11]Su H， Takagawa J， Huang Y， et al. Additive effect of AAV-mediated angiopoietin-1 and VEGF expression on the therapy of infarcted heart[J]. Int J Cardiol， 2009， 133（2）： 191-7