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【中图分类号】R979.9 【文献标识码】A 【文章编号】1550-1868（2015）03
【摘要】本文对一种二氢卟吩衍生物（DPX）作为光动力抗肿瘤药物进行了初步研究。在体外，DPX能有效的抑制人脑胶质瘤U87的生长。在体内，接受DPX-TM光动力治疗的肿瘤生长速度明显减慢，肿瘤体积显著变小。研究表明二氢卟吩衍生物（DPX）用于PDT能有效的抑制肿瘤， 有成为新型光动力抗肿瘤药物的潜能。
【关键词】光动力治疗；光敏剂；二氢卟吩衍生物；抗肿瘤
肿瘤是严重威胁人类生命的常见病、多发病。在癌症治疗的众多方法中，光动力治疗（ Photodynamic Therapy， PDT）是一种治疗恶性肿瘤的新方法[1]。自问世至今的几十年来， PDT在癌症的临床治疗中已取得了令人瞩目的成就，以其有效、安全、副作用小、可协同性、可重复性和相对低成本等优点脱颖而出，并且在肿瘤的治疗中显示出很强的生命力，为中晚期、特别是无法（或拒绝）采用传统方法治疗的癌症患者提供了一个机会，增加了一种治疗手段[2]。
PDT的原理是光敏剂被靶细胞吸收后，在一定波长激光照射下，从基态（S0）跃迁到激发态（S1），通过系间串跃进一步跃迁到三线态激发态（T1），处于三线态的光敏剂与周围分子发生反应（主要有type I型和type II型），产生高氧化活性的自由基（如单线态氧），杀伤靶细胞；并破坏照射区域血管，阻断靶细胞营养和氧供给；同时激发机体免疫调节，导致肿瘤坏死[3]。
光敏剂是光动力治疗肿瘤的关键之一，长久以来，为了适应光动力治疗的需要，人们研制了多种光敏剂用于PDT治疗[4]。在此，我们对一种二氢卟吩衍生物（DPX）作为光动力抗肿瘤药物进行了初步研究。
1实验材料
1.1试剂 DPX由本实验室自主合成。实验中所用试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，且未做任何预处理。细胞培养所用材料均购自上海元象生物科技有限公司。
1.2实验细胞 人脑胶质瘤U87细胞，购自中国科学院上海细胞库。
1.3实验动物 BABL/c 裸鼠，5～ 6 周龄， 体重 10～12 g ，18只，SPF 级， 购自中国科学院实验动物中心。
2方法与结果
2.1紫外吸收光谱和荧光光谱的测定 化合物DPX用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为5 μM的溶液，然后用紫外分光光度计和荧光光譜仪测定紫外吸收光谱和荧光光谱。DPX在420 nm和653nm处有极强的紫外吸收， 在527 nm， 552 nm， 600nm处也有较弱的紫外吸收；以波长为653 nm的激光激发DPX时，在656 nm处能检测到极强的荧光信号，说明该化合物可用于荧光诊断，且检测波长为656 nm.
2.2单线态氧生成速率的测定 使用N，N-二甲基酰胺（DMF）溶液配置成终浓度为20μM DPBF和0.5 μM DPX的工作液，利用UV-Vis测定化合物的扫描波谱。将工作液加入石英管中，调节激光强度5 mW/cm2照射溶液（λ=650 nm），每隔10秒测定紫外图谱，记录在410 nm处紫外吸收度值[5。单线态氧生成速率根据公式（1）进行计算得出。
In[DPBF]t/[DPBF]0=-kt （1）
其中[DPBF]0为起始吸光强度，[DPBF]t为某一时刻的吸光强度；t为时间；k为DPBF消耗的速率常数，即单线态氧生成速率。
溶液在 410 nm处紫外吸收度值随着光照时间的增加而减少，说明有单线态氧的产生，单线态氧的生成速率为0.0299.
3. 噻唑蓝（MTT）检测体外DPX抗肿瘤活性 U87细胞以5×104的密度接种于96孔培养板中，待细胞铺满70- 80 % 96孔板，加入含有不同浓度（0μM、2μM、4μM、6μM、8μM）DPX的细胞培养液，继续避光孵育24h；吸除上清含药培养液，加入新鲜的培养液，实验组采用635nm的激光进行照射，光剂量分别为1.2 J/cm2、2.4 J/cm2、3.6 J/cm2。对照组作为暗毒性实验，不进行照光；照光后继续培养4h。吸除培养液，每孔加入10% MTT溶液（5mg/ml）的含FBS的培养液200μl，继续于37℃，5%CO2孵箱中培养4 h。终止培养，小心吸取孔内培养的上清液，每孔加入DMSO 150μl，室温下将培养板置于振荡器上振荡10 min，使甲臜充分溶解。选择570 nm波长，使用酶标仪测定各孔光吸收值（OD value）。
结果如图1，在孵育过后不给予光照，DPX具有很低的毒性；然而给予光照后，DPX的毒性增加，且随着药物浓度的增加/光剂量的增加，细胞存活率减少。
图1 U87细胞的存活率曲线图
4. DPX体内抗肿瘤活性的评价 取对数生长期U87细胞，0.25%胰酶含0.02% EDTA消化制成细胞悬液，并计数，调成细胞浓度1×107/ml，取0.2 ml接种于昆明小鼠右后腿部皮下。待肿瘤长到直径为5-7mm时，随机分为对照组和PDT组。PDT组，DPX以5 mg/kg的剂量，采用尾静脉注射，再以波长650 nm的He-Ne激光照射肿瘤局部；对照组给予同样体积的生理盐水，再照射肿瘤局部。光照后，每隔一天用电子游标卡尺测量结节长度（a），宽度（b），求出近似瘤体积（V）=a×b2×1/2。
激光照射后肿瘤表面可见充血、发红。其中接受DPX-PDT 治疗的小鼠， 瘤体表面出现局部坏死，2～3 d 后肿瘤组织坏死，溃烂，结痂；14d左右，结痂出现脱落。DPX-PDT治疗组肿瘤体积与对照组相比明显减小（图2），差异有显著性意义.
图2 肿瘤生长曲线
5. 统计学分析：所有数据均进行单因素方差分析，组间比较采用 t 检验， P <0.05 有显著意义。 討论
光动力疗法是继手术、放疗和化疗之后的又一种肿瘤治疗新技术。其治疗基础为先给与对肿瘤组织有选择性摄入作用的光敏剂，然后用一定波长的光照辐照瘤区，有光敏剂诱发光动力效应，导致肿瘤组织坏死而显示治疗作用的[6]。
在体外，DPX对于U87细胞具有极低的暗毒性，但是光照过后，不同浓度的DPX对于U87细胞均有不同抑制生长的作用，且有浓度/光剂量-效应关系。
在荷U87肿瘤裸小鼠体内，DPX-PDT组，光照后肿瘤组织坏死，溃烂，结痂，肿瘤体积与对照组相比明显减小。
以上实验结果提示了DPX有望成为新型光动力抗肿瘤药物，值得进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金（21372042， 21402236， 81101298， 81301878）， 上海市科委基金（14431906200， 14140903500， 13431900700， 13430722300， 13ZR1441000， 13ZR1440900， 14ZR1439800， 14ZR1439900， 15ZR1439900， 15XD1523400， 14SJGGYY08， 201370），中国国际合作基金（6-11）， 义乌市科技局基金 （2012-G3-02， 2013-G3-03） .
参考文献
[1]Ackroyd， R.， et al.， The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochem Photobiol， 2001. 74（5）： p. 656-69.
[2]Brundish， D.E. and W.G. Love， Photodynamic therapy comes of age. IDrugs， 2000. 3（12）： p. 1487-508.
[3]Zhang， L.J.， et al.， Photosensitizing effectiveness of a novel chlorin-based photosensitizer for photodynamic therapy in vitro and in vivo. J Cancer Res Clin Oncol， 2014. 140（9）： p. 1527-36.
[4]Chen， Y.H.， G.L. Li， and R.K. Pandey， Synthesis of bacteriochlorins and their potential utility in photodynamic therapy （PDT）. Current Organic Chemistry， 2004. 8（12）： p. 1105-1134.
[5]Ashen-Garry， D. and M. Selke， Singlet oxygen generation by cyclometalated complexes and applications. Photochem Photobiol， 2014. 90（2）： p. 257-74.
[6]Dima， V.F.， et al.， Photodynamic therapy and some clinical applications in oncology. Roum Arch Microbiol Immunol， 2002. 61（3）： p. 159-205.
【摘要】本文对一种二氢卟吩衍生物（DPX）作为光动力抗肿瘤药物进行了初步研究。在体外，DPX能有效的抑制人脑胶质瘤U87的生长。在体内，接受DPX-TM光动力治疗的肿瘤生长速度明显减慢，肿瘤体积显著变小。研究表明二氢卟吩衍生物（DPX）用于PDT能有效的抑制肿瘤， 有成为新型光动力抗肿瘤药物的潜能。
【关键词】光动力治疗；光敏剂；二氢卟吩衍生物；抗肿瘤
肿瘤是严重威胁人类生命的常见病、多发病。在癌症治疗的众多方法中，光动力治疗（ Photodynamic Therapy， PDT）是一种治疗恶性肿瘤的新方法[1]。自问世至今的几十年来， PDT在癌症的临床治疗中已取得了令人瞩目的成就，以其有效、安全、副作用小、可协同性、可重复性和相对低成本等优点脱颖而出，并且在肿瘤的治疗中显示出很强的生命力，为中晚期、特别是无法（或拒绝）采用传统方法治疗的癌症患者提供了一个机会，增加了一种治疗手段[2]。
PDT的原理是光敏剂被靶细胞吸收后，在一定波长激光照射下，从基态（S0）跃迁到激发态（S1），通过系间串跃进一步跃迁到三线态激发态（T1），处于三线态的光敏剂与周围分子发生反应（主要有type I型和type II型），产生高氧化活性的自由基（如单线态氧），杀伤靶细胞；并破坏照射区域血管，阻断靶细胞营养和氧供给；同时激发机体免疫调节，导致肿瘤坏死[3]。
光敏剂是光动力治疗肿瘤的关键之一，长久以来，为了适应光动力治疗的需要，人们研制了多种光敏剂用于PDT治疗[4]。在此，我们对一种二氢卟吩衍生物（DPX）作为光动力抗肿瘤药物进行了初步研究。
1实验材料
1.1试剂 DPX由本实验室自主合成。实验中所用试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，且未做任何预处理。细胞培养所用材料均购自上海元象生物科技有限公司。
1.2实验细胞 人脑胶质瘤U87细胞，购自中国科学院上海细胞库。
1.3实验动物 BABL/c 裸鼠，5～ 6 周龄， 体重 10～12 g ，18只，SPF 级， 购自中国科学院实验动物中心。
2方法与结果
2.1紫外吸收光谱和荧光光谱的测定 化合物DPX用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为5 μM的溶液，然后用紫外分光光度计和荧光光譜仪测定紫外吸收光谱和荧光光谱。DPX在420 nm和653nm处有极强的紫外吸收， 在527 nm， 552 nm， 600nm处也有较弱的紫外吸收；以波长为653 nm的激光激发DPX时，在656 nm处能检测到极强的荧光信号，说明该化合物可用于荧光诊断，且检测波长为656 nm.
2.2单线态氧生成速率的测定 使用N，N-二甲基酰胺（DMF）溶液配置成终浓度为20μM DPBF和0.5 μM DPX的工作液，利用UV-Vis测定化合物的扫描波谱。将工作液加入石英管中，调节激光强度5 mW/cm2照射溶液（λ=650 nm），每隔10秒测定紫外图谱，记录在410 nm处紫外吸收度值[5。单线态氧生成速率根据公式（1）进行计算得出。
In[DPBF]t/[DPBF]0=-kt （1）
其中[DPBF]0为起始吸光强度，[DPBF]t为某一时刻的吸光强度；t为时间；k为DPBF消耗的速率常数，即单线态氧生成速率。
溶液在 410 nm处紫外吸收度值随着光照时间的增加而减少，说明有单线态氧的产生，单线态氧的生成速率为0.0299.
3. 噻唑蓝（MTT）检测体外DPX抗肿瘤活性 U87细胞以5×104的密度接种于96孔培养板中，待细胞铺满70- 80 % 96孔板，加入含有不同浓度（0μM、2μM、4μM、6μM、8μM）DPX的细胞培养液，继续避光孵育24h；吸除上清含药培养液，加入新鲜的培养液，实验组采用635nm的激光进行照射，光剂量分别为1.2 J/cm2、2.4 J/cm2、3.6 J/cm2。对照组作为暗毒性实验，不进行照光；照光后继续培养4h。吸除培养液，每孔加入10% MTT溶液（5mg/ml）的含FBS的培养液200μl，继续于37℃，5%CO2孵箱中培养4 h。终止培养，小心吸取孔内培养的上清液，每孔加入DMSO 150μl，室温下将培养板置于振荡器上振荡10 min，使甲臜充分溶解。选择570 nm波长，使用酶标仪测定各孔光吸收值（OD value）。
结果如图1，在孵育过后不给予光照，DPX具有很低的毒性；然而给予光照后，DPX的毒性增加，且随着药物浓度的增加/光剂量的增加，细胞存活率减少。
图1 U87细胞的存活率曲线图
4. DPX体内抗肿瘤活性的评价 取对数生长期U87细胞，0.25%胰酶含0.02% EDTA消化制成细胞悬液，并计数，调成细胞浓度1×107/ml，取0.2 ml接种于昆明小鼠右后腿部皮下。待肿瘤长到直径为5-7mm时，随机分为对照组和PDT组。PDT组，DPX以5 mg/kg的剂量，采用尾静脉注射，再以波长650 nm的He-Ne激光照射肿瘤局部；对照组给予同样体积的生理盐水，再照射肿瘤局部。光照后，每隔一天用电子游标卡尺测量结节长度（a），宽度（b），求出近似瘤体积（V）=a×b2×1/2。
激光照射后肿瘤表面可见充血、发红。其中接受DPX-PDT 治疗的小鼠， 瘤体表面出现局部坏死，2～3 d 后肿瘤组织坏死，溃烂，结痂；14d左右，结痂出现脱落。DPX-PDT治疗组肿瘤体积与对照组相比明显减小（图2），差异有显著性意义.
图2 肿瘤生长曲线
5. 统计学分析：所有数据均进行单因素方差分析，组间比较采用 t 检验， P <0.05 有显著意义。 討论
光动力疗法是继手术、放疗和化疗之后的又一种肿瘤治疗新技术。其治疗基础为先给与对肿瘤组织有选择性摄入作用的光敏剂，然后用一定波长的光照辐照瘤区，有光敏剂诱发光动力效应，导致肿瘤组织坏死而显示治疗作用的[6]。
在体外，DPX对于U87细胞具有极低的暗毒性，但是光照过后，不同浓度的DPX对于U87细胞均有不同抑制生长的作用，且有浓度/光剂量-效应关系。
在荷U87肿瘤裸小鼠体内，DPX-PDT组，光照后肿瘤组织坏死，溃烂，结痂，肿瘤体积与对照组相比明显减小。
以上实验结果提示了DPX有望成为新型光动力抗肿瘤药物，值得进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金（21372042， 21402236， 81101298， 81301878）， 上海市科委基金（14431906200， 14140903500， 13431900700， 13430722300， 13ZR1441000， 13ZR1440900， 14ZR1439800， 14ZR1439900， 15ZR1439900， 15XD1523400， 14SJGGYY08， 201370），中国国际合作基金（6-11）， 义乌市科技局基金 （2012-G3-02， 2013-G3-03） .
参考文献
[1]Ackroyd， R.， et al.， The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochem Photobiol， 2001. 74（5）： p. 656-69.
[2]Brundish， D.E. and W.G. Love， Photodynamic therapy comes of age. IDrugs， 2000. 3（12）： p. 1487-508.
[3]Zhang， L.J.， et al.， Photosensitizing effectiveness of a novel chlorin-based photosensitizer for photodynamic therapy in vitro and in vivo. J Cancer Res Clin Oncol， 2014. 140（9）： p. 1527-36.
[4]Chen， Y.H.， G.L. Li， and R.K. Pandey， Synthesis of bacteriochlorins and their potential utility in photodynamic therapy （PDT）. Current Organic Chemistry， 2004. 8（12）： p. 1105-1134.
[5]Ashen-Garry， D. and M. Selke， Singlet oxygen generation by cyclometalated complexes and applications. Photochem Photobiol， 2014. 90（2）： p. 257-74.
[6]Dima， V.F.， et al.， Photodynamic therapy and some clinical applications in oncology. Roum Arch Microbiol Immunol， 2002. 61（3）： p. 159-205.