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摘要：综述了免疫-PCR的进展状况，包括PCR的基本原理、PCR的改进、灵敏度、抗体/DNA marker连接物的制备、显示系统、免疫PCR种类以及假阳性的控制等。
关键词：免疫PCR 基本原理 灵敏度 PCR种类
中图分类号：R446.6 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）18-0071-02
1992年Sano等人将免疫测定技术与聚合酶链反应(PCR)技术结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫—PCR。该技术正是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，这种灵敏程度使免疫检测技术达到了一个新的高度。现在将免疫—PCR技术研究进展综述如下：
1 免疫—PCR的基本原理
免疫—PCR主要由两部分组成。第一部分是类似于普通酶联免疫吸附试验(ELISA)的抗原抗体反应，第二部分是常规的PCR扩增和电泳检测。免疫—PCR与ELISA的区别就在于ELlSA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果，而免疫—PCR则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接DNA，并进行电泳检测，因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量。免疫—PCR的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。
2 免疫-PCR的灵敏度
Sano T等應用免疫—PCR检测包被在ELISA板上的牛血清白蛋白，比应用碱性磷酸酶染色的ELISA法，在检测灵敏度上大约增加×105，由于PCR的巨大扩增能力和特异性，使得免疫—PCR技术灵敏度高于目前存在的任何抗原检测系统，理论上可检测单分子抗原。人甲状腺刺激素(TSH)是评价甲状腺功能的指标，血标本中正常浓度较低(5×10-12mmol/L，25×10-16mmol/L)，临床一般用放射免疫测定超过了ELISA的检测范围。Hendrickson等用三明治夹心法免疫—PCR检测TSH水平1fg(10-12mmol)。而用夹心法ELISA检测水平[pg(10-16mol)前者灵敏度比后者高3个数量级。
3 免疫—PCR的改进
虽然Sano PP等人构建的免疫—PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子链亲和素—蛋白A嵌合体还没有商品化，因此限制了他在实际应用中的广泛普及。Ruzicka等人以生物素化的抗体取代Sano免疫—PCR系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素—蛋白A嵌合体作为连接分了构建了一个新的免疫—PCR系统。Ruzicka用此免疫—PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体，可以检测出包被浓度为10fg/ml的E抗体。此外，Sano的免疫—PCR实验流程需要众多的洗涤步骤，使实验过程相当繁琐，并需要大量的操作时间。Zhou等人对此作了改进，他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进行免疫-PCR实验，把每个步骤的洗涤次数从原先的7～15次减至3～5次，从而减少了操作时间，但不影响实验结果的准确性。另外，用修饰过的抗原稀释缓冲液代替Sano免疫—PCR中的TBS作为抗原稀释液，它主要把TBS中胍的浓度调到2mmol/L，由此解决了抗原的溶解问题。Zhou检测了人原癌基因ETS，检测浓度可达9.6×1015mmol/L，是常规ELISA的10倍，与Sano的免疫—PCR系统相比，Ruzicka和Zhou所用的方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素(链亲和素)都已商品化，因此在实际操作中得到广泛应用。
4 免疫—PCR的种类
多抗原分析物免疫—PCR，就是同时检测多种抗原。放射性同位素、荧光索、酶和化学发光法标记的抗体，已被开发用于多分析物的检测，但来自不同标记的重叠信号和扫描不同信号密度上的困难，使上述方法尚未试用，相对而言，DNA为多分析物区分提供了理想的分子标记。大小不同的DNA分子可以通过电泳准确、定量地区分。Hendrickson等用99个碱基的寡核甘酸标记的HCG抗体、85个碱基寡核苷酸标记的TsII抗体和55个碱基募核苷酸标记，β—Cal抗体同时检测HCC、TSH 、β—Cal3个分析物，而PCR扩增时，3个寡核苷酸应用一对引物，但产物分子质量各为99bp、85bp、55bp，因而各个抗原得以鉴定，Zhou和Hendrickson分别谈到单引物免疫—PCR，所谓单引物免疫—PCR，就是标记抗体的DNA指示分子的两侧翼含相同的引物序列，可用单引物PCR扩增。该法可提高PCR扩增效率，且适于多抗原免疫-PCR。双相免疫—PCR，就是同时检测病原体抗原又检测病体基因的免疫—PCR，其原理就是一对用于扩增某病原体基因的引物，被人工加在标记抗体的DNA marker的两端，使二者共用一对引物，但产物分子量大小不同，达到免疫—PCR在检测抗原的同时，又检测了目的基因。总之，目前而言，免疫—PCR可分为单分析物免疫—PCR、多分析物免疫-PCR、单引物免疫-PCR以及双和免疫-PCR。
5 展望
免疫—PCR作为一种抗原检测系统，同时具有抗原抗体反应的特异性和PCR的高灵敏度，适合于各种微量抗原的检测，并可以直接检测细胞上抗原。预先将抗体和标记DNA偶联，简化了实验操作，并可同时检测多种抗原。而标记物和引物被设计为带有亲和配体，则可用常规ETISA法检测，随着免疫—PCR技术的进一步发展完善，免疫—PCR的功能将得到更充分的发展，新的标记物和引物设计将扩展可检测分析的范围，简化实验的复杂性具有侧链DNA标记物的偶联物能够承担的标记物的检测，产生更准确的结果，相信不久就会有商品化的免疫—PCR试剂盒问世。
参考文献
[1] Bortolin S,Christopoulos TS %26 Verhaegen m.Anal.Chem,1996;68:834～840.
[2] Van Gijlswijk RPM,et al.J Immunol Methods,1996,189:117～127.
[3] Kakizaki E,Yoskida T,Kawakami H,et al.Lett.Appl microbiol,1996,23(2):101～103.
[4] Hendrickson ER,Hatfield TM,Joerger RD,et al.Nucleic Acids res,1995,23(3):522～529.
[5] Maia M,Takahashis H,Adler K,et al.J Virol methods,1995,52(3):273～278.
[6] Sano T,Smith CL,Cantor CR.Science,1992,258(5079):120～122.
[7] Sanna PP,Weiss F,Samson ME,et aL.Proc.Natl Acad Sci uSA,1995,92:272～275.
[8] Numata Y,Matsumoto Y.Clin Chim.Acta.1997,259(1～2):169～176.
[9] Mweene AS,Okazaki K,Kide H,et al.Jpn J vet,Res,1996,44(3):165～174.
关键词：免疫PCR 基本原理 灵敏度 PCR种类
中图分类号：R446.6 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）18-0071-02
1992年Sano等人将免疫测定技术与聚合酶链反应(PCR)技术结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫—PCR。该技术正是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，这种灵敏程度使免疫检测技术达到了一个新的高度。现在将免疫—PCR技术研究进展综述如下：
1 免疫—PCR的基本原理
免疫—PCR主要由两部分组成。第一部分是类似于普通酶联免疫吸附试验(ELISA)的抗原抗体反应，第二部分是常规的PCR扩增和电泳检测。免疫—PCR与ELISA的区别就在于ELlSA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果，而免疫—PCR则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接DNA，并进行电泳检测，因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量。免疫—PCR的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。
2 免疫-PCR的灵敏度
Sano T等應用免疫—PCR检测包被在ELISA板上的牛血清白蛋白，比应用碱性磷酸酶染色的ELISA法，在检测灵敏度上大约增加×105，由于PCR的巨大扩增能力和特异性，使得免疫—PCR技术灵敏度高于目前存在的任何抗原检测系统，理论上可检测单分子抗原。人甲状腺刺激素(TSH)是评价甲状腺功能的指标，血标本中正常浓度较低(5×10-12mmol/L，25×10-16mmol/L)，临床一般用放射免疫测定超过了ELISA的检测范围。Hendrickson等用三明治夹心法免疫—PCR检测TSH水平1fg(10-12mmol)。而用夹心法ELISA检测水平[pg(10-16mol)前者灵敏度比后者高3个数量级。
3 免疫—PCR的改进
虽然Sano PP等人构建的免疫—PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子链亲和素—蛋白A嵌合体还没有商品化，因此限制了他在实际应用中的广泛普及。Ruzicka等人以生物素化的抗体取代Sano免疫—PCR系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素—蛋白A嵌合体作为连接分了构建了一个新的免疫—PCR系统。Ruzicka用此免疫—PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体，可以检测出包被浓度为10fg/ml的E抗体。此外，Sano的免疫—PCR实验流程需要众多的洗涤步骤，使实验过程相当繁琐，并需要大量的操作时间。Zhou等人对此作了改进，他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进行免疫-PCR实验，把每个步骤的洗涤次数从原先的7～15次减至3～5次，从而减少了操作时间，但不影响实验结果的准确性。另外，用修饰过的抗原稀释缓冲液代替Sano免疫—PCR中的TBS作为抗原稀释液，它主要把TBS中胍的浓度调到2mmol/L，由此解决了抗原的溶解问题。Zhou检测了人原癌基因ETS，检测浓度可达9.6×1015mmol/L，是常规ELISA的10倍，与Sano的免疫—PCR系统相比，Ruzicka和Zhou所用的方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素(链亲和素)都已商品化，因此在实际操作中得到广泛应用。
4 免疫—PCR的种类
多抗原分析物免疫—PCR，就是同时检测多种抗原。放射性同位素、荧光索、酶和化学发光法标记的抗体，已被开发用于多分析物的检测，但来自不同标记的重叠信号和扫描不同信号密度上的困难，使上述方法尚未试用，相对而言，DNA为多分析物区分提供了理想的分子标记。大小不同的DNA分子可以通过电泳准确、定量地区分。Hendrickson等用99个碱基的寡核甘酸标记的HCG抗体、85个碱基寡核苷酸标记的TsII抗体和55个碱基募核苷酸标记，β—Cal抗体同时检测HCC、TSH 、β—Cal3个分析物，而PCR扩增时，3个寡核苷酸应用一对引物，但产物分子质量各为99bp、85bp、55bp，因而各个抗原得以鉴定，Zhou和Hendrickson分别谈到单引物免疫—PCR，所谓单引物免疫—PCR，就是标记抗体的DNA指示分子的两侧翼含相同的引物序列，可用单引物PCR扩增。该法可提高PCR扩增效率，且适于多抗原免疫-PCR。双相免疫—PCR，就是同时检测病原体抗原又检测病体基因的免疫—PCR，其原理就是一对用于扩增某病原体基因的引物，被人工加在标记抗体的DNA marker的两端，使二者共用一对引物，但产物分子量大小不同，达到免疫—PCR在检测抗原的同时，又检测了目的基因。总之，目前而言，免疫—PCR可分为单分析物免疫—PCR、多分析物免疫-PCR、单引物免疫-PCR以及双和免疫-PCR。
5 展望
免疫—PCR作为一种抗原检测系统，同时具有抗原抗体反应的特异性和PCR的高灵敏度，适合于各种微量抗原的检测，并可以直接检测细胞上抗原。预先将抗体和标记DNA偶联，简化了实验操作，并可同时检测多种抗原。而标记物和引物被设计为带有亲和配体，则可用常规ETISA法检测，随着免疫—PCR技术的进一步发展完善，免疫—PCR的功能将得到更充分的发展，新的标记物和引物设计将扩展可检测分析的范围，简化实验的复杂性具有侧链DNA标记物的偶联物能够承担的标记物的检测，产生更准确的结果，相信不久就会有商品化的免疫—PCR试剂盒问世。
参考文献
[1] Bortolin S,Christopoulos TS %26 Verhaegen m.Anal.Chem,1996;68:834～840.
[2] Van Gijlswijk RPM,et al.J Immunol Methods,1996,189:117～127.
[3] Kakizaki E,Yoskida T,Kawakami H,et al.Lett.Appl microbiol,1996,23(2):101～103.
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[5] Maia M,Takahashis H,Adler K,et al.J Virol methods,1995,52(3):273～278.
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[8] Numata Y,Matsumoto Y.Clin Chim.Acta.1997,259(1～2):169～176.
[9] Mweene AS,Okazaki K,Kide H,et al.Jpn J vet,Res,1996,44(3):165～174.