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【摘要】 目的：采用免疫组化技术探讨不同程度宫颈病变组织中P16、Ki-67的表达。方法：收集770例宫颈上皮内瘤变病理标本，进行常规病理诊断和免疫组化检测，观察P16、Ki-67在宫颈标本中的表达。结果：随着宫颈疾病的加重，P16呈逐渐弥漫阳性表达，并且阳性表达率逐渐增加，同时Ki-67指数也同时升高。结论：宫颈病理标本进行P16联合Ki-67检测可以提高诊断准确率，减少误诊漏诊。
【关键词】 宫颈上皮内瘤变； 病理诊断； 免疫组化
【Abstract】 Objective：To investigative the expression of P16 and Ki-67 in different degree of cervical lesion using immunohistochemistry.Method：A total of 770 patients with cervial intraepithelial neoplasia were chose and received routine pathological diagnosis and immunohistochemical detection of P16 and Ki-67.Result：P16 was gradually filled with positive expression and positive expression rate increased with higher Ki-67 index following the deterioration of cervical diseases.Conclusion：Immunohistochemical detection of P16 and Ki-67 might improve diagnistic accuracy and decrease misdiagnosis.
【Key words】 Cervical conization intraepithelial neoplasia； Pathological diagnosis； Immunohistochemistry
First-author’s address：Liuzhou Matemity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou 545001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.29.013
宫颈上皮内瘤变（CIN）是一组与宫颈浸润癌密切相关的癌前期病变的统称，是常见的妇科疾病。CIN的提出表明由宫颈炎发展到宫颈癌是一个连续过渡的过程，即由CINⅠ→CINⅡ→CINⅢ→早期浸润癌→浸润癌的一系列病理变化[1-4]。在我国宫颈癌是威胁女性生殖健康的常见恶性肿瘤之一，早期宫颈癌筛查对女性健康具有非常重要的意义。国家卫计委对中国广大农村进行“两癌筛查”专项扶持，并取得了显著的成就，使宫颈癌成为一种可以有效防治的恶性肿瘤，因此提高宫颈上皮内瘤变诊断的准确性对有效防治宫颈癌具有重要的作用。近年来，随着科技的进步，人们发现P16免疫组化染色可以提高宫颈上皮内瘤变的诊断准确率[5-7]。2014年WHO女性生殖系统分类中，在宫颈鳞状细胞癌前病变中推荐使用P16免疫组化染色将鳞状上皮内病变进行两级分类，即低级别鳞状上皮内瘤变（LSIL）和高级别鳞状上皮内瘤变（HSIL），LSIL相当于CINⅠ，HSIL相当于CINⅡ和CINⅢ[8]。目前研究认为HSIL，与高危险型HPV，如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68有关，LSIL与低危险型HPV包括HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44和一过性高危HPV感染有关[2-4]。临床诊疗指南认为高级别鳞状上皮内瘤变通过锥切治疗可以降低宫颈癌的发生，低级别鳞状上皮内瘤变保守治疗即可，但已有研究发现有些CINⅡ经过保守治疗后会转变为CINⅠ，有些CINⅠ保守治疗会进展到CINⅡ[8-10]。因此，认为2014年WHO女性生殖系统分类存在一定的局限性。本项研究采用免疫组化技术探讨P16、Ki-67在宫颈上皮内瘤变的病理诊断中的作用，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2015年1-7月来柳州市妇幼保健院妇科就诊的宫颈疾病患者活检标本770例，平均年龄（29.8±6.4）岁，其中病理诊断结果为慢性炎529例，平均年龄（29.9±6.9）岁；CINⅠ级85例，平均年龄（29.0±5.3）岁；CINⅡ级47例，平均年龄（29.7±5.1）岁；CINⅢ级64例，平均年龄（28.8±8.2）岁；宫颈癌45例，平均年龄（31.5±6.9）岁。各宫颈疾病患者年龄比较，差异无统计学意义（F=0.262，P=0.901>0.05）。
1.2 方法
1.2.1 常规组织病理操作 标本经10%福尔马林溶液固定，病理取材，脱水机（thermo）常规过夜脱水，石蜡包埋，手摇切片机5 μm连续切片后行HE染色，由两名经验丰富的病理医师进行病理诊断阅片。
1.2.2 P16、Ki-67免疫组化染色 免疫组化使用VENTANA的P16、Ki-67一抗采用VENTANA全自动检测法。石蜡切片后，65 ℃烤片2 h。上机开始免疫组化染色，染色结束后封片，两名经验丰富的病理医师进行免疫组化阅片，结合常规病理与免疫组化染色进行诊断。
1.2.3 宫颈上皮病变的治疗 根据临床诊疗指南，慢性炎和CINⅠ级临床给予保守治疗，CINⅡ级和CINⅢ级需要锥切；宫颈癌需要进行子宫切除手术治疗。
1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，计量资料采用方差分析法（ONE WAY ANOVO法），组间采用LSD双重比较法进行统计分析；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 不同程度宫颈病变P16的表达 P16阳性为胞质、胞核共同表达。结果显示，在正常鳞状上皮和良性增生的鳞状上皮P16呈阴性；在宫颈不成熟鳞化中呈不连续片状或斑片状分布，阳性强度较弱，阳性率<5%；CINⅠ级既有阴性表达，也有弥漫的阳性表达；但CINⅡ～Ⅲ级、宫颈癌中呈连续弥漫强阳性，见图1。同时P16阳性表达率由慢性炎的1.70%增加到CINⅠ级的95.12%和CINⅡ级、CINⅢ级、宫颈癌的100%（ 字2=699.301，P=0.000<0.01），见表1。
2.2 不同程度宫颈病变Ki-67的表达 Ki-67阳性为细胞核表达。结果显示在正常或反应性增生的宫颈上皮阳性率<10%，而且主要分布在基底层和副基底层；随着宫颈上皮内瘤变级别的升高，Ki-67阳性细胞的分布不再局限于底层细胞，逐渐向中层和表层扩展蔓延，并且表达与病变程度基本一致，见图1。Ki-67阳性指数也随着疾病程度加重而增加，由慢性炎的<10%（基层阳性）增加到宫颈癌的（90.50±5.24）%（F=182.55，P=0.000<0.01），见表2。
3 讨论
P16是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新型抑癌基因，是一种周期依赖性蛋白激酶抑制剂，直接作用于细胞周期发挥负调控作用。已有研究证实P16与肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、淋巴瘤、恶性黑色素廇的发病有关[11-13]。因此，有学者将P16比作细胞周期中刹车装置，一旦失灵就会导致恶性肿瘤的发生。P16在宫颈癌及癌前病变高表达，这是由于HPV早期基因E7蛋白限制了Rb蛋白释放转录因子E2F，诱导P16过表达。因此，P16被用作宫颈癌及癌前病变诊断的高敏感性的标记物，并用作宫颈癌及宫颈上皮瘤变的辅助诊断，是宫颈癌早期诊断的标记物。随着研究的深入，P16在宫颈病变中的诊断作用日益突出，并写入2014年WHO女性生殖系统肿瘤的病理诊断中[14-18]。大量研究证实宫颈癌和癌前病变P16阳性表达。在本项研究中，P16随着病情加重表达逐渐增强，阳性表达率增加，在高级别上皮内瘤变（CINⅡ级、CINⅢ级）和宫颈癌中表达率达100%，但不能区分肿瘤类型，如鳞癌或腺癌，提示P16可以用于定性判定宫颈上皮内瘤变的病情，但不能用于鉴别诊断。
Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关。Ki-67作为标记细胞增殖状态的抗原，Ki-67表达范围覆盖除G0期以外的所有增殖周期细胞，可较好地用于检测组织中的增殖细胞，但在静止期细胞不表达。细胞增殖是一个被高度协调机制控制的基本生物过程，人体复杂的调控机制负责胚胎的正常发育、伤害和感染等的调控，一旦调控平衡被打破，就可能产生肿瘤。因此，肿瘤的发生、发展与细胞的异常增殖密不可分。有研究表明Ki-67增殖指数的高低与肿瘤的分化程度、浸润转移以及预后密切相关，阳性说明癌细胞增殖活跃，提示肿瘤更容易进展。Ki-67在低分化癌组织中的表达较在中高分化癌组织的表达明显升高，表明Ki-67染色阳性程度与组织学分级的相关性，高Ki-67的患者生存时间明显缩短[19-20]。目前，Ki-67可以被用作肿瘤发生发展及肿瘤细胞活性的指标。研究表明Ki-67阳性指数升高与乳腺癌的发生发展有关，对乳腺癌的诊断治疗和预后评价具有重要的参考价值。Ki-67与大肠癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌等恶性肿瘤的进展也密切相关[21-22]。在本项研究中，Ki-67在宫颈慢性炎只是基层表达，随着病情的加重表达阳性指数逐渐增加，宫颈癌Ki-67阳性指数达到（90.50±5.24）%，可以定量评价宫颈疾病的病情程度。
综上所述，P16和Ki-67的表达与宫颈疾病的病情程度密切相关。正常的宫颈上皮通常P16表达阴性，Ki-67基层阳性表达。随着病情加重，P16阳性表达逐步增强，其阳性表达率和Ki-67的阳性指数逐渐增加。在宫颈癌P16表达呈弥漫强阳性，Ki-67阳性指数大于80%。在病灶太小，临床医生取材太碎或过度钳夹、烧灼等情况下，P16联合Ki-67免疫组化检测可以大大提升了诊断准确率，避免了漏诊误诊。
参考文献
[1]庞保红，黄育姬，何报宁.玉州区2009～2012年农村已婚妇女宫颈癌筛查结果分析[J].广西医学，2014，36（2）：230-232.
[2]贺婵娟，姚德生，卢艳.导流杂交法检测宫颈病变中人乳头瘤病毒的基因型及其感染的临床意义[J].广西医学，2012，34（5）：531-533.
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[13] Mahajan A.Practical issues in the application of p16 immunohistochemistry in diagnostic pathology[J].Hum Pathol，2016，51：64-74.
[14]李绍刚，殷伟杰，李赛飞.238例宫颈细胞学和组织学对照分析及p16在组织学诊断中的应用[J].临床与实验病理学杂志，2015，31（3）：330-332.
[15]陆晓青，陈洁瑛，朱晓萍，等.液基薄层细胞学及荧光定量聚合酶链反应技术与P16蛋白联合检查在宫颈癌早期诊断的研究[J].中华医院感染学杂志，2015，25（7）：1478-1480.
[16]戈文舜，任丽芳，李美平，等.细胞块p16联合高危型HPV检测在ASCUS患者分流管理中的作用[J].临床与实验病理学杂志，2014，30（8）：868-870，875.
[17]杨君，周德平，王彬，等.宫颈上皮内瘤变组织中P16蛋白表达与HR-HPV病毒载量的相关性研究[J].实用妇产科杂志，2014，30（4）：43-45.
[18]何惠华，刘汉忠，涂宁芳，等.宫颈腺癌合并鳞状上皮内瘤变人乳头状瘤病毒亚型感染与p16蛋白表达的关系[J].中华医院感染学杂志，2014，24（23）：5799-5801.
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（收稿日期：2016-01-16） （本文编辑：程旭然）
【关键词】 宫颈上皮内瘤变； 病理诊断； 免疫组化
【Abstract】 Objective：To investigative the expression of P16 and Ki-67 in different degree of cervical lesion using immunohistochemistry.Method：A total of 770 patients with cervial intraepithelial neoplasia were chose and received routine pathological diagnosis and immunohistochemical detection of P16 and Ki-67.Result：P16 was gradually filled with positive expression and positive expression rate increased with higher Ki-67 index following the deterioration of cervical diseases.Conclusion：Immunohistochemical detection of P16 and Ki-67 might improve diagnistic accuracy and decrease misdiagnosis.
【Key words】 Cervical conization intraepithelial neoplasia； Pathological diagnosis； Immunohistochemistry
First-author’s address：Liuzhou Matemity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou 545001，China
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宫颈上皮内瘤变（CIN）是一组与宫颈浸润癌密切相关的癌前期病变的统称，是常见的妇科疾病。CIN的提出表明由宫颈炎发展到宫颈癌是一个连续过渡的过程，即由CINⅠ→CINⅡ→CINⅢ→早期浸润癌→浸润癌的一系列病理变化[1-4]。在我国宫颈癌是威胁女性生殖健康的常见恶性肿瘤之一，早期宫颈癌筛查对女性健康具有非常重要的意义。国家卫计委对中国广大农村进行“两癌筛查”专项扶持，并取得了显著的成就，使宫颈癌成为一种可以有效防治的恶性肿瘤，因此提高宫颈上皮内瘤变诊断的准确性对有效防治宫颈癌具有重要的作用。近年来，随着科技的进步，人们发现P16免疫组化染色可以提高宫颈上皮内瘤变的诊断准确率[5-7]。2014年WHO女性生殖系统分类中，在宫颈鳞状细胞癌前病变中推荐使用P16免疫组化染色将鳞状上皮内病变进行两级分类，即低级别鳞状上皮内瘤变（LSIL）和高级别鳞状上皮内瘤变（HSIL），LSIL相当于CINⅠ，HSIL相当于CINⅡ和CINⅢ[8]。目前研究认为HSIL，与高危险型HPV，如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68有关，LSIL与低危险型HPV包括HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44和一过性高危HPV感染有关[2-4]。临床诊疗指南认为高级别鳞状上皮内瘤变通过锥切治疗可以降低宫颈癌的发生，低级别鳞状上皮内瘤变保守治疗即可，但已有研究发现有些CINⅡ经过保守治疗后会转变为CINⅠ，有些CINⅠ保守治疗会进展到CINⅡ[8-10]。因此，认为2014年WHO女性生殖系统分类存在一定的局限性。本项研究采用免疫组化技术探讨P16、Ki-67在宫颈上皮内瘤变的病理诊断中的作用，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2015年1-7月来柳州市妇幼保健院妇科就诊的宫颈疾病患者活检标本770例，平均年龄（29.8±6.4）岁，其中病理诊断结果为慢性炎529例，平均年龄（29.9±6.9）岁；CINⅠ级85例，平均年龄（29.0±5.3）岁；CINⅡ级47例，平均年龄（29.7±5.1）岁；CINⅢ级64例，平均年龄（28.8±8.2）岁；宫颈癌45例，平均年龄（31.5±6.9）岁。各宫颈疾病患者年龄比较，差异无统计学意义（F=0.262，P=0.901>0.05）。
1.2 方法
1.2.1 常规组织病理操作 标本经10%福尔马林溶液固定，病理取材，脱水机（thermo）常规过夜脱水，石蜡包埋，手摇切片机5 μm连续切片后行HE染色，由两名经验丰富的病理医师进行病理诊断阅片。
1.2.2 P16、Ki-67免疫组化染色 免疫组化使用VENTANA的P16、Ki-67一抗采用VENTANA全自动检测法。石蜡切片后，65 ℃烤片2 h。上机开始免疫组化染色，染色结束后封片，两名经验丰富的病理医师进行免疫组化阅片，结合常规病理与免疫组化染色进行诊断。
1.2.3 宫颈上皮病变的治疗 根据临床诊疗指南，慢性炎和CINⅠ级临床给予保守治疗，CINⅡ级和CINⅢ级需要锥切；宫颈癌需要进行子宫切除手术治疗。
1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，计量资料采用方差分析法（ONE WAY ANOVO法），组间采用LSD双重比较法进行统计分析；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 不同程度宫颈病变P16的表达 P16阳性为胞质、胞核共同表达。结果显示，在正常鳞状上皮和良性增生的鳞状上皮P16呈阴性；在宫颈不成熟鳞化中呈不连续片状或斑片状分布，阳性强度较弱，阳性率<5%；CINⅠ级既有阴性表达，也有弥漫的阳性表达；但CINⅡ～Ⅲ级、宫颈癌中呈连续弥漫强阳性，见图1。同时P16阳性表达率由慢性炎的1.70%增加到CINⅠ级的95.12%和CINⅡ级、CINⅢ级、宫颈癌的100%（ 字2=699.301，P=0.000<0.01），见表1。
2.2 不同程度宫颈病变Ki-67的表达 Ki-67阳性为细胞核表达。结果显示在正常或反应性增生的宫颈上皮阳性率<10%，而且主要分布在基底层和副基底层；随着宫颈上皮内瘤变级别的升高，Ki-67阳性细胞的分布不再局限于底层细胞，逐渐向中层和表层扩展蔓延，并且表达与病变程度基本一致，见图1。Ki-67阳性指数也随着疾病程度加重而增加，由慢性炎的<10%（基层阳性）增加到宫颈癌的（90.50±5.24）%（F=182.55，P=0.000<0.01），见表2。
3 讨论
P16是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新型抑癌基因，是一种周期依赖性蛋白激酶抑制剂，直接作用于细胞周期发挥负调控作用。已有研究证实P16与肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、淋巴瘤、恶性黑色素廇的发病有关[11-13]。因此，有学者将P16比作细胞周期中刹车装置，一旦失灵就会导致恶性肿瘤的发生。P16在宫颈癌及癌前病变高表达，这是由于HPV早期基因E7蛋白限制了Rb蛋白释放转录因子E2F，诱导P16过表达。因此，P16被用作宫颈癌及癌前病变诊断的高敏感性的标记物，并用作宫颈癌及宫颈上皮瘤变的辅助诊断，是宫颈癌早期诊断的标记物。随着研究的深入，P16在宫颈病变中的诊断作用日益突出，并写入2014年WHO女性生殖系统肿瘤的病理诊断中[14-18]。大量研究证实宫颈癌和癌前病变P16阳性表达。在本项研究中，P16随着病情加重表达逐渐增强，阳性表达率增加，在高级别上皮内瘤变（CINⅡ级、CINⅢ级）和宫颈癌中表达率达100%，但不能区分肿瘤类型，如鳞癌或腺癌，提示P16可以用于定性判定宫颈上皮内瘤变的病情，但不能用于鉴别诊断。
Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关。Ki-67作为标记细胞增殖状态的抗原，Ki-67表达范围覆盖除G0期以外的所有增殖周期细胞，可较好地用于检测组织中的增殖细胞，但在静止期细胞不表达。细胞增殖是一个被高度协调机制控制的基本生物过程，人体复杂的调控机制负责胚胎的正常发育、伤害和感染等的调控，一旦调控平衡被打破，就可能产生肿瘤。因此，肿瘤的发生、发展与细胞的异常增殖密不可分。有研究表明Ki-67增殖指数的高低与肿瘤的分化程度、浸润转移以及预后密切相关，阳性说明癌细胞增殖活跃，提示肿瘤更容易进展。Ki-67在低分化癌组织中的表达较在中高分化癌组织的表达明显升高，表明Ki-67染色阳性程度与组织学分级的相关性，高Ki-67的患者生存时间明显缩短[19-20]。目前，Ki-67可以被用作肿瘤发生发展及肿瘤细胞活性的指标。研究表明Ki-67阳性指数升高与乳腺癌的发生发展有关，对乳腺癌的诊断治疗和预后评价具有重要的参考价值。Ki-67与大肠癌、甲状腺癌、卵巢癌、膀胱癌等恶性肿瘤的进展也密切相关[21-22]。在本项研究中，Ki-67在宫颈慢性炎只是基层表达，随着病情的加重表达阳性指数逐渐增加，宫颈癌Ki-67阳性指数达到（90.50±5.24）%，可以定量评价宫颈疾病的病情程度。
综上所述，P16和Ki-67的表达与宫颈疾病的病情程度密切相关。正常的宫颈上皮通常P16表达阴性，Ki-67基层阳性表达。随着病情加重，P16阳性表达逐步增强，其阳性表达率和Ki-67的阳性指数逐渐增加。在宫颈癌P16表达呈弥漫强阳性，Ki-67阳性指数大于80%。在病灶太小，临床医生取材太碎或过度钳夹、烧灼等情况下，P16联合Ki-67免疫组化检测可以大大提升了诊断准确率，避免了漏诊误诊。
参考文献
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[8] Clinton L K，Miyazaki K，Ayabe A，et al.The LAST guidelines in clinical practice：implementing recommendations for p16 use[J].Am J Clin Pathol，2015，144（6）：844-849. [9] Thrall M J.Effect of lower anogenital squamous terminology recommendations on the use of p16 immunohistochemistry and the proportion of high-grade diagnoses in cervical biopsy specimens[J].Am J Clin Pathol，2016，145（4）：524-530.
[10] Miyamoto S，Hasegawa J，Morioka M，et al.The association between p16 and Ki-67 immunohistostaining and the progression of cervical intraepithelial neoplasia grade 2[J].Int J Gynaecol Obstet，2016，134（1）：45-48.
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（收稿日期：2016-01-16） （本文编辑：程旭然）