论文部分内容阅读
摘要：目的：探讨实时定量PCR与传统培养在血流感染病原体检测中的临床应用价值。方法：收集医院各科室血流感染患者血液标本106份，同时进行实时定量PCR和血培养，检测和计算实时定量PCR的特异性、敏感性，以及与血培养的一致性。结果：106份样本中检测出10中病原体，实时定量PCR检测出24份阳性，82份阴性，其中阳性与血培养一致的有8份，阴性与血培养一致的有77例，两种检测方法一致性为80.2%；实时定量PCR的NPV为93.9%，敏感度为61.5%，特异性为82.8%；5例为PCR阴性血培养阳性，16例为PCR阳性而血培养阴性；此外有1个样本超出PCR检测范围，而血培养为阳性。结论：实时定量PCR检测血流感染患者病原体，具有速度快、敏感性好、特异性好的优势，但在临床应用中仍需将常规细菌培养作为重要补充。
关键词：实时定量PCR；血流感染；病原体
血流感染是菌血症和败血症的统称，近年来由于诊疗技术的提高和激素、抗生素的廣泛运用，血流感染的发生率不断升高[1]。血流感染患者病死率较高，住院时间也相对较长，不仅增加患者经济负担，也给患者造成较大危害。因此，快速、准确的检测出血流病原体，并及时给予患者针对性的抗生素治疗，对于降低病死率有重要意义。传统的培养方法主要是血培养，但培养结果需要等待较长时间，尤其是某些营养需求复杂、生长缓慢的病原体，培养时间甚至超过48小时。此外患者接受抗生素治疗后，其血培养的阳性率也会明显降低[2]。为了提高血流感染诊断的敏感性、特异性和速度，本文利用实时定量PCR检测血流感染病原体，取得较满意的结果，现将详细情况做如下汇报。
1.资料与方法
1.1一般资料
选取我院各个科室收治的血流感染患者82例，总共取得106份样本。其中男性48例，女性34例，年龄29～56岁，平均年龄（42.8±12.4）岁。其中有55例患者来自肿瘤科、麻醉科和ICU，其余来自血液科与内科。70例患者在血液采集前进行过抗菌药物治疗。
1.2方法
采集静脉血液样本后同时进行实时定量PCR和血培养，其中血培养选择BD 9050全自动血培养仪，并在37摄氏度条件下培养1～5天后，严格按照相关操作规范分离和鉴定病原体。并将含有EDTA的静脉血5ml进行实时定量PCR，仪器选择Ligt-Cycler 2.0，操作步骤参照LightCycler SeptiFast，SeptiFast Prep和SeptiFast Lys试剂盒[3]。病原体的检测利用专门的识别软件对峰值做检测，并以阳性做对照，若检测样本无峰值，对照是阳性，则判定为阴性。
1.3统计学方法
本文采用SPSS17.0统计分析软件，根据检测结果计算实时定量PCR与血培养的特异性、敏感性、阴性预测值（NPV），并计算两种检测方法的一致性。
2、结果
表1 两种检测方法检出结果比较
血培养 实时定量PCR 合计
阴性 阳性
阴性
阳性
合计 77
5
82 16
8
24 93
13
106
82例血流感染患者培养标本后总共获得10株致病菌，其中1株为真菌，4株为革兰氏阴性菌，5株为革兰氏阳性菌，常见的细菌有铜绿假单胞菌、金大肠杆菌、粪肠球菌等。两种检测方法检测106份血液样本，检测均为阴性的有77例，均为阳性的有8例；实时定量PCR检测出24份阳性，82份阴性，其中5例为PCR阴性血培养阳性，16例为PCR阳性而血培养阴性；实时定量PCR与血培养的NPV为93.9%（77/82），敏感度为61.5%（8/13），特异性为82.8%（77/93），两种方法的一致性为80.2%（85/106）。16例PCR阳性而血培养阴性中，有5例埃希菌，4例为肠球菌，2例为肠杆菌，2例为假单胞菌，3例为金黄色葡球菌。实时定量PCR的假阴性率为4.72%（5/106），假阳性为15.1%（16/106）。详见下表1。
3、讨论
近年来，已有大量研究证明分子生物学技术在无菌标本中能够成功对单个细菌或真菌进行鉴定与基因型分析，但是90%的菌血症甚至败血症是由25 种主要的细菌引起，所以如何能够快速鉴定出引起血流感染的具体病原体则需要更加巧妙的方法[4]。血流感染新的诊断技术关键在于提高检测的敏感性与特异性，尤其是对于生长缓慢的细菌与苛养菌的检测，尤为重要。同时提高检测速度、缩短鉴定周期，并降低甚至消除抗生素使用对检测的影响。实时定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号积累，实时监测PCR的整个过程，并运用标准曲线定量分析未知模板的一种方法。由于实时定量PCR的反应和监测是一次性完成的，极大的降低了感染发生率，因此被广泛应用于临床病原体检测中。本文同时运用实时定量PCR和血培养检测血流感染患者病原体，结果显示PCR的敏感度为61.5%，特异性为82.8%。本文研究中对于血培养为阴性的患者，也用实时定量PCR检测此类患者的其他部位标本，如呼吸道的分泌物，并且检测出3例患者带病原体。相对而言，实时定量PCR更能够反映患者的真实感染情况。
研究表明，血液中细菌的DNA可能与SIRS的的发生及血流感染之间有一定的关联，而实时定量PCR不但可以检测病原体及其DNA，还可以为临床提供许多价值较高的信息。本文PCR的假阴性有5例，假阴性率为4.72%，与国外研究相近，其中有1份标本的病原体不在实时定量PCR的扩增谱范围之内，另外4份是真菌感染。真菌是PCR出现假阴性的重要原因，可能是因为PCR反应抑制或者自我扩增的效率较低，这与国外研究结果一致[5]。然而实时定量PCR也存在一些不足，比如在病原体耐药性相关资料的可获得性上，PCR无法像常规血培养一样可获得，其检测谱的范围也相对狭窄，尤其是一些罕见病原体，因此检测受到一定限制。总之，实时定量PCR检测血流感染患者病原体，具有速度快，敏感性、特异性好的优势，但在临床应用中仍需将常规细菌培养作为重要补充。
参考文献：
[1]焦巍，彭莉.Real time PCR与常规血培养在血流感染未知病原体鉴定中的比较研究[J].中外医疗，2014，（15）：31-32.
[2]石建玲，程波，刘珊等.基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国实验诊断学，2013，17（6）：986-989.
[3]欧阳松应，杨冬，欧阳红生等.实时荧光定量PCR技术及其应用[J].生命的化学，2004，24（1）：74-76.
[4]陈旭，齐凤坤，康立功等.实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].东北农业大学学报，2010，41（8）：148-155.
[5]张志明，朱建伟，李建平等.实时荧光定量聚合酶链反应在检测大肠埃希菌引起血流感染中的应用[J].新乡医学院学报，2011，28（1）：1-3.
资助基金：湖南省教育厅青年项目（14B185）
关键词：实时定量PCR；血流感染；病原体
血流感染是菌血症和败血症的统称，近年来由于诊疗技术的提高和激素、抗生素的廣泛运用，血流感染的发生率不断升高[1]。血流感染患者病死率较高，住院时间也相对较长，不仅增加患者经济负担，也给患者造成较大危害。因此，快速、准确的检测出血流病原体，并及时给予患者针对性的抗生素治疗，对于降低病死率有重要意义。传统的培养方法主要是血培养，但培养结果需要等待较长时间，尤其是某些营养需求复杂、生长缓慢的病原体，培养时间甚至超过48小时。此外患者接受抗生素治疗后，其血培养的阳性率也会明显降低[2]。为了提高血流感染诊断的敏感性、特异性和速度，本文利用实时定量PCR检测血流感染病原体，取得较满意的结果，现将详细情况做如下汇报。
1.资料与方法
1.1一般资料
选取我院各个科室收治的血流感染患者82例，总共取得106份样本。其中男性48例，女性34例，年龄29～56岁，平均年龄（42.8±12.4）岁。其中有55例患者来自肿瘤科、麻醉科和ICU，其余来自血液科与内科。70例患者在血液采集前进行过抗菌药物治疗。
1.2方法
采集静脉血液样本后同时进行实时定量PCR和血培养，其中血培养选择BD 9050全自动血培养仪，并在37摄氏度条件下培养1～5天后，严格按照相关操作规范分离和鉴定病原体。并将含有EDTA的静脉血5ml进行实时定量PCR，仪器选择Ligt-Cycler 2.0，操作步骤参照LightCycler SeptiFast，SeptiFast Prep和SeptiFast Lys试剂盒[3]。病原体的检测利用专门的识别软件对峰值做检测，并以阳性做对照，若检测样本无峰值，对照是阳性，则判定为阴性。
1.3统计学方法
本文采用SPSS17.0统计分析软件，根据检测结果计算实时定量PCR与血培养的特异性、敏感性、阴性预测值（NPV），并计算两种检测方法的一致性。
2、结果
表1 两种检测方法检出结果比较
血培养 实时定量PCR 合计
阴性 阳性
阴性
阳性
合计 77
5
82 16
8
24 93
13
106
82例血流感染患者培养标本后总共获得10株致病菌，其中1株为真菌，4株为革兰氏阴性菌，5株为革兰氏阳性菌，常见的细菌有铜绿假单胞菌、金大肠杆菌、粪肠球菌等。两种检测方法检测106份血液样本，检测均为阴性的有77例，均为阳性的有8例；实时定量PCR检测出24份阳性，82份阴性，其中5例为PCR阴性血培养阳性，16例为PCR阳性而血培养阴性；实时定量PCR与血培养的NPV为93.9%（77/82），敏感度为61.5%（8/13），特异性为82.8%（77/93），两种方法的一致性为80.2%（85/106）。16例PCR阳性而血培养阴性中，有5例埃希菌，4例为肠球菌，2例为肠杆菌，2例为假单胞菌，3例为金黄色葡球菌。实时定量PCR的假阴性率为4.72%（5/106），假阳性为15.1%（16/106）。详见下表1。
3、讨论
近年来，已有大量研究证明分子生物学技术在无菌标本中能够成功对单个细菌或真菌进行鉴定与基因型分析，但是90%的菌血症甚至败血症是由25 种主要的细菌引起，所以如何能够快速鉴定出引起血流感染的具体病原体则需要更加巧妙的方法[4]。血流感染新的诊断技术关键在于提高检测的敏感性与特异性，尤其是对于生长缓慢的细菌与苛养菌的检测，尤为重要。同时提高检测速度、缩短鉴定周期，并降低甚至消除抗生素使用对检测的影响。实时定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号积累，实时监测PCR的整个过程，并运用标准曲线定量分析未知模板的一种方法。由于实时定量PCR的反应和监测是一次性完成的，极大的降低了感染发生率，因此被广泛应用于临床病原体检测中。本文同时运用实时定量PCR和血培养检测血流感染患者病原体，结果显示PCR的敏感度为61.5%，特异性为82.8%。本文研究中对于血培养为阴性的患者，也用实时定量PCR检测此类患者的其他部位标本，如呼吸道的分泌物，并且检测出3例患者带病原体。相对而言，实时定量PCR更能够反映患者的真实感染情况。
研究表明，血液中细菌的DNA可能与SIRS的的发生及血流感染之间有一定的关联，而实时定量PCR不但可以检测病原体及其DNA，还可以为临床提供许多价值较高的信息。本文PCR的假阴性有5例，假阴性率为4.72%，与国外研究相近，其中有1份标本的病原体不在实时定量PCR的扩增谱范围之内，另外4份是真菌感染。真菌是PCR出现假阴性的重要原因，可能是因为PCR反应抑制或者自我扩增的效率较低，这与国外研究结果一致[5]。然而实时定量PCR也存在一些不足，比如在病原体耐药性相关资料的可获得性上，PCR无法像常规血培养一样可获得，其检测谱的范围也相对狭窄，尤其是一些罕见病原体，因此检测受到一定限制。总之，实时定量PCR检测血流感染患者病原体，具有速度快，敏感性、特异性好的优势，但在临床应用中仍需将常规细菌培养作为重要补充。
参考文献：
[1]焦巍，彭莉.Real time PCR与常规血培养在血流感染未知病原体鉴定中的比较研究[J].中外医疗，2014，（15）：31-32.
[2]石建玲，程波，刘珊等.基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国实验诊断学，2013，17（6）：986-989.
[3]欧阳松应，杨冬，欧阳红生等.实时荧光定量PCR技术及其应用[J].生命的化学，2004，24（1）：74-76.
[4]陈旭，齐凤坤，康立功等.实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].东北农业大学学报，2010，41（8）：148-155.
[5]张志明，朱建伟，李建平等.实时荧光定量聚合酶链反应在检测大肠埃希菌引起血流感染中的应用[J].新乡医学院学报，2011，28（1）：1-3.
资助基金：湖南省教育厅青年项目（14B185）