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摘 要：为了比较农业生产型林业中的木聚糖，使用木聚糖RmXyn10A的两种变体，只有源自海洋红嗜热盐菌的全长酶和催化模块，对硬木（桦木）木聚糖和谷物（黑麦）阿拉伯木聚糖进行水解。用含有水解产物的低聚木糖（XOS）作为碳源，培养4种精选的细菌菌种，结果显示了短乳杆菌DSMZ 1264和青春双歧杆菌ATCC 15703出现选择性生长。这两种菌株被证实可利用低聚木糖组分（DP 2 -5）；而来自黑麦阿拉伯木聚糖水解产物的假定阿拉伯低聚木糖仅能被青春双歧杆菌利用。大肠杆菌不能生长，但能在单糖阿拉伯糖和木糖上生长。研究还表明，小片球菌（Pediococcus parvulus）2.6株既不能利用木糖，也不能利用低聚木糖进行生长。总之，RmXyn10A或其催化模块证实可用于硬木木聚糖和谷物阿拉伯木聚糖的高温水解，产生XOS，因此能在功能性食品中充当益生元。
关键词：黑麦阿拉伯木聚糖；GH10木聚糖酶；短乳杆菌；青春双歧杆菌；低聚木糖
中图分类号：S816.75 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2014）02-0008-06
由于生物质在能源、化学品和食品生产领域中的未来需求，生物质利用是现今人们普遍关注的话题。因此，令人感兴趣的是开发相差技术来改善目前对生物质资源利用不充分的现状，如半纤维素。木聚糖是半纤维素最常见的类型，是由线性β-1，4-木糖主链和不同程度的短侧链构成的非均质聚合物；其结构和成分因植物的来源、部位、年龄以及其纯化加工方法的不同而各异。硬木所含的主要半纤维素几乎相同，为O-乙酰基-4-O-甲基葡萄糖醛酸-β-D-木聚糖，有时也称为甲基葡萄糖醛酸木聚糖（acetylglucuronoxylan）。来自草类植物（含谷物）的异质木聚糖具有与β-1，4-木糖残基相同的主链，但通常有更多分支。此外，该侧链含有大量的L-阿拉伯糖残基，它可能与其它糖类同时出现，如木糖和半乳糖，或与阿魏酸或香豆酸同时出现。这些取代基随机出现在聚合物中，使未被取代的木聚糖向外扩展。在评估木聚糖加工对环境的影响时，较之化学试剂而言，由于控制催化作用可行，因此，木聚糖酶发生酶片断化更有利于环境，能限制副产品的形成，无需使用刺激性化学品，符合绿色化学前景。木聚糖酶属于糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GH），由于其通常易于处理，且无需辅因子，因而在工业上极具吸引力。木聚糖酶（EC 3.2.1.8）可根据不同的GH家族进行分类，如GH5、GH7、GH8、GH10、GH11、GH43，取决于不同酶的序列和结构相似度。GH10和GH11由具有内切-1，4-β木聚糖酶活性的酶支配，能对主链中1，4-β-D-木糖苷键的随机水解进行催化。包括GH43在内的一些GH家族还聚集着外作用酶，如木糖苷酶（EC 3.2.1.37），能在木聚糖聚合物的非还原端对末端的木糖残基进行连续水解，或在GH8中发现的外木聚糖酶（EC 3.2.1 0.156），能对除去低聚木聚糖还原端的终端木糖进行催化。以往的研究表明，木聚糖酶携带的碳水化合物结合模块（Carbohydrate-Binding Module，CBM）能对木质纤维素底物的水解产生显著影响，可能依赖于酶和底物的种类和复杂程度。为了获得低聚糖，只有内切木聚糖酶才合适，因为它们对木聚糖聚合物更随机的作用将产生多种低聚糖产物。如果该作用在高于室温的环境下进行，耐热木聚糖内切酶能得到使用。酶解反应在较高的温度下进行有许多好处，因为这样的反应条件会提高底物的溶解性，降低其粘度，如果考虑处理工艺，这样做也能减少酶处理步骤之前的冷却成本，并减少处理时微生物污染的风险。由于高温能促进酶渗透和细胞壁的降解，因此，耐热酶的变体在处理农作物或原木等资源时具有优势。
在对谷物木聚糖，尤其是来自小麦的那些木聚糖，进行水解处理时产生的阿拉伯木寡糖（AXOS）和低聚木糖（XOS），最近已作为新的不易消化的低聚糖得到研究。这些低聚糖已得到广泛的评估，且安全可食用，并通过动物和人的试验证实对健康有益。通过实验室条件和自然条件下的发酵实验，多项研究证实它们具有益生元功能，表明低聚糖的发酵促进了益生菌的生长速度。
益生菌是一种进入结肠中存活的微生物，它们在结肠中发挥出对宿主健康有益的作用，并已证明通过提高抗菌物质的分泌来平衡肠道菌群，以调节宿主的免疫系统。乳酸杆菌和双歧杆菌被公认为是益生菌的代表菌种。它们的存在能抑制不需要或有害的（病原）细菌，减少许多结肠疾病的风险，如炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）、急性溃疡性结肠炎和节段性回肠炎（克罗恩氏病，Crohn’s disease）。此外，据称，动物总体健康状况受结肠健康状态的影响。最近的多项研究表明，乳酸杆菌和双歧杆菌的优选菌株能发酵源自木聚糖的寡糖。如果青春双歧杆菌在XOS上的生长速度高于在构成的单糖木糖上的速度，那就证明低聚木糖对青春双歧杆菌有巨大的生长促进作用。许多研究表明，双歧杆菌还能利用AXOS，并且能切割阿拉伯糖侧链的数种酶已得到鉴定。然而，仍不清楚的是某些乳酸杆菌菌种是否真的能发酵AXOS。人们对鉴定利用XOS的乳酸菌新菌株和找到生产XOS的新办法仍感兴趣。在进行生长研究时，并没有很多研究对从复杂的水解混合物中吸收单个低聚糖进行分析。
在这项研究中，源自硬木（桦木）和谷物（黑麦）的两种木聚糖模型被用作利用耐热聚糖酶（RmXyn10A）进行酶解反应的底物，以获取一系列的低聚木糖。这些原料用GH10家族的RmXyn10A进行处理，在温度高于80 ℃产生活性，分别从硬木和谷物的木聚糖中获得XOS和AXOS。该木聚糖酶的两个变体被作为水解的生物催化剂进行评估：一个变体由2个主要结合木聚糖的CBMs在内的5个模块组成，构成完整原酶长度，另一个变体组成了该酶的独立催化模块（Catalytic Module，CM）。酶处理后得到的水解产物被用作生长试验的碳源。如上所述，AXOS被认为具有益生元的功能，而源自硬木的木聚糖酶的水解产物XOS较少得到研究。本研究中用于测试水解产物生长情况的三种益生菌/假定性益生元菌菌株分别为小片球菌、青春双歧杆菌和短乳杆菌。根据假定性促健康型乳酸菌胞外多糖的生成，以及人类服用含有小片球菌和双岐杆菌属菌种协调细胞培养物的燕麦奶后表现出胆固醇降低的情况选择小片球菌2.6。病原菌对照实验组还使用了肠道菌群中不太受欢迎的细菌——大肠杆菌。 1 原料与方法
1.1 耐热木聚糖酶的制备
来自海洋红嗜热盐菌的木聚糖酶Xyn10A和来自相同酶的独立催化模块（CM），其生产方法是利用大肠杆菌BL21（DE3）在添加了氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中进行分批培养，并在对数中期阶段用IPTG进行诱导。细胞颗粒在结合缓冲液中再次悬浮，并在5 min的间隔按5×5 min的方法用超声波在冰上进行裂解。裂解细胞在20 min内在离心力5 500 g下的离心，然后用70 ℃水浴进行热处理30 min，部分纯化耐热木聚糖酶。正如其它文章介绍的那样，热处理后，含有组氨酸标记的木聚糖酶的上清液，用固定化金属离子亲和层析法进行纯化。咪唑则作为洗脱缓冲液。洗脱的蛋白在20 mM磷酸钠缓冲液、pH值为7.5、气温为4 ℃的情况下进行夜间透析（20 kDa）。木聚糖溶液的纯度用SDS-PAGE（瑞典Bio-Rad公司）和12.5 %的丙烯酰胺进行测定。木聚糖酶的总浓度和酶活性在报告条件下用二喹啉蛋白测定法（德国Sigma公司）和二硝基水杨酸阻止法进行测定。按照含1 %木聚糖的20 mM、pH 7.5的磷酸钠缓冲溶液中规定浓度的木糖标准，根据标准曲线对木聚糖酶的活性进行评估。木聚糖酶的活性以每摩尔木聚糖酶释放还原木糖残基[katal（mol/s）]表示。
1.2 木聚糖和阿拉伯木聚糖的水解
来自桦木X 0502（德国Sigma公司）的木聚糖含90 %以上的木糖，来自黑麦粉 P-RAXY（爱尔兰Megazyme公司）含90 %的碳水化合物（阿拉伯糖38 %、木糖59 %、3 %其它糖），经纯净的木聚糖内切酶变体水解。利用溶解在pH 7.5磷酸钠缓冲液、浓度为10 g/L的桦木木聚糖或黑麦粉阿拉伯木聚糖中60 nM木聚糖酶，在70 ℃活跃状态下进行水解反应的计时研究。反应结束后在头6 h内按2 h的时间间隔进行采样，24 h后再进行一次采样。采集的样本按下文的HPAEC-PAD法进行分析。用于分批培养实验的XOS水解物用相同的方法准备，但须在超纯水（Milli-Q）中进行，这样，反应在4 h后终止。为了中止木聚糖内切酶的活性，立即将样本浸入沸水30 min，并在室温下进行冷却，然后将它们注入圆底烧瓶进行冷冻干燥。
1.3 水解的木聚糖和阿拉伯木聚糖的分析
水解的桦木木聚糖和黑麦阿拉伯基木聚糖中的寡糖，用高效阴离子交换色谱—脉冲安培检测法（High-Performance Anion Exchange Chromatography With Pulsed Amperometric Detection，HPAEC-PAD）进行分析：使用同材料内径250 mm×4 min，8.5 μm的CarboPac PA100柱和同材料50 mm×4 mm（美国Dionex公司）的保护柱，恒定100 mM NaOH的流动相（1 mL/min），10～160 mM和160～400 mM的梯度醋酸钠溶液0～20 min和20～ 25 min。阿拉伯糖（瑞士Fluka公司）、木糖（德国Merck公司）、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖（Megazyme公司）的样品使用10 μL注射剂来确定色谱的峰值。在分析和与这些样品进行比较前用超纯水稀释。
1.4 细菌菌株和生长介质
用于测试水解木聚糖发酵能力的细菌菌株是青春双歧杆菌ATCC15703、短乳杆菌DSMZ1264、小片球菌2.6和大肠杆菌BL21（美国Novagen公司）。青春双歧杆菌、短乳杆菌、小片球菌和大肠杆菌都是用葡萄糖作为碳源进行两次预培养。
青春型双歧杆菌在37 ℃下接种于双歧杆菌媒介中。该媒介含12.5 g酪蛋白胨、胰蛋白酶消化液、6.25 g酵母抽提物、6.25 g肉汁、6.25 g细菌大豆胨、2.5 g的K2PO4、0.25 g的MgSO4·7H2O、0.0 625 g的MnSO4·H2O、6.25 g的NaCL氯化钠和每升含1.25 mL吐温80。向此溶液中加入5 mL刃天青（25 mg/100 mL）溶液和50 mL盐水，盐水中含有0.25 g的CaCl2·H2O，0.5 g的MgSO4·7H2O，1 g的KH2PO4，10 g的NaHCO3，2 g的NaCl。随后将该媒介煮沸，并在N 2气体中冷却。加入半胱氨酸，浓度达到0.625 g/L，并用NaOH调节到pH 6.8。
在37 ℃的厌氧条件下，短乳杆菌大MRS液体培养基（pH 6.7）中厌氧培养。
在30 ℃下，小片球菌大MRS培养基（pH 5.2）厌氧培养。在这种情况下，接种培养物在红霉素存在的情况下生长，维持胞外多糖制备质粒（EPS质粒）。
大肠杆菌首先在LB琼脂培养基上划线接种，并在37 ℃下培养。随后，单菌落转移到以葡萄糖为碳源的新鲜mAT培养基中，并在37 ℃下进行有氧培养。然后，细胞转移到新鲜mAT培养基中，当细胞已经达到早期稳定期时，它们在不同的碳源条件下于37 ℃进行厌氧培养。
相应的碳源——阿拉伯糖、葡萄糖和木糖为过滤器，通过0.22 μm过滤器进行杀菌，而黑麦阿拉伯木聚糖（RAX）、水解的黑麦阿拉伯木聚糖（H-RAX）、桦木木聚糖（BX）和水解的桦木木聚糖（H-BX）在121 ℃下 分别进行15 min的高压灭菌。在培养开始时，将无菌碳源加入到相应的培养基中，根据总糖或水解产物浓度，以5 mg/mL的浓度进行无碳源制备。对所有菌株而言，无碳源的介质还用于阴性对照。
培养试验的所有介质——肉汁和琼脂，在121 ℃经15 min的高压灭菌。所有用于厌氧生长的培养介质将含有氮气的厌氧管伸入介质中取代其中的氧气而进行脱氧气。然后，所有将厌氧管用金属瓶盖封闭，并在121 ℃下经15 min高压灭菌。随后，在用于实验前将它们在4 ℃下保存。 1.5 分批发酵试验
青春双歧杆菌、短乳杆菌和小片球菌分别在各自的培养基中预接种24 h，大肠杆菌则预接种7 h，然后将培养物转移到新鲜的培养基中进行厌氧分批发酵试验。接种培养基中的细胞颗粒，以3 200 g的离心力离心15 min，进行收集，随后用0.9 %的盐水漂洗2次。
接种物占总体积的2 %（体积/体积），但小片球菌除外，后者占培养物的4 %（体积/体积）。青春双歧杆菌、短乳杆菌和大肠杆菌的厌氧培养在37 ℃下培养72 h，而小片球菌则在30 ℃下培养72 h，此温度是这种菌株的最佳生长温度。每一个发酵试验中，每一种碳源均用两根试管，其中一根试管是对照试管，不含碳源。每根试管的总容积为10 mL：8 mL为制备的培养基，2 mL为加入的碳水化合物底物或作为对照的无菌水。
细胞培养物在72 h内以每隔24 h的间隔进行采样，对其生长、pH值和碳源的利用情况进行分析。细胞密度作为细菌生长的量度标准，通过在620 nm处测量光密度（OD）来确定。分别取200 μL青春双歧杆菌、短乳杆菌和大肠杆菌培养物的样本，用一块微量培养板测定它们的生长情况，而小片球菌则用Biowave Ⅱ紫外-可见分光光度计（英国Biochrom公司）和一个1 mL的小玻璃管测定其生长速度。倍比稀释和总平板计数（CFU/mL）用来确认72 h时的小片球菌生长量。测定pH值以评估培养基中的产酸量。细菌在不同碳水化合物来源条件下的碳水化合物利用能力用HPAEC-PAD测定。
2 结果和讨论
2.1 木聚糖酶活性测定
RmXyn10A是一种模块化的GH10木聚糖酶，源自海洋红嗜热盐菌。纯合的RmXyn10A变体FL，即全长酶和CM，也就是说是一个带有唯一催化模块的构建体，首次得到了分析，以比较它们活性的最佳值，以及在桦木木聚糖和黑麦粉阿拉伯木聚糖底物上的特殊活性。
以桦木木聚糖为底物，对该木聚糖酶变体在pH 7.5的最佳温度下进行测定。根据先前仅使用催化模块进行测定的结果，RmXyn10A的全长和催化模块产生活性的最佳温度为80 ℃（图1）。
之前的热失活实验表明，该催化模块在此温度下半衰期为100 min，而在70 ℃下24 h内完全稳定。为了用木聚糖底物进行长时间培养且不会丧失活性，本试验决定在70 ℃进行。此外，据证实，灭活该酶的所用方法已得到证实，本试验中是CM，在木聚糖（煮沸30 min，然后高压灭菌）水解后，导致酶完全失活。在煮沸后，酶的活性约残留15 %，而高压灭菌使木聚糖酶完全灭活。
对硬木木聚糖和谷物阿拉伯木聚糖的特殊活性在全长酶（FL）和70 ℃时的CM进行测定，结果在两个底物上处于相同的范围。全长酶的活性略高（桦木木聚糖为106±3 kat/mol，黑麦粉阿拉伯木聚糖为109±3 kat/mol），而CM的活性略低（桦木木聚糖为71±2 kat/mol，黑麦粉阿拉伯木聚糖为93±3 kat/mol）。然而，不同底物的活性差异很小，表明在FL上的CBMs作用有限。尽管FL的活性略高，我们决定继续只研究CM，因为CM更容易生产，并具有较高的热稳定性。
2.2 水解产物的组成和XOS水解物的制备
CM和FL在低程度的聚合作用（DP）范围（未给出数据）内会产生相同的水解产物模式，刺激持续使用唯一的一种酶变体。下一个试验只使用CM。
因此，使用两种浓度的CM进行时间进程研究，以监控寡糖的产生。如图2A和3A所示，木四糖（X4）和木五糖（X5）首先形成，随后进一步降解成木三糖（X3）、木二糖（X2）和木糖（X）。
这表明，X2是桦木木聚糖水解的最终产物，X3、X2和X缓慢降解产生有限的X，这一结果与先前对该酶的研究数据一致，表明可水解的最小XOS底物为X3。值得注意的还有图2A中12～15 min的峰值，这很可能是XOS被4-O-甲基葡萄糖醛酸取代的结果。黑麦粉阿拉伯木聚糖被水解成XOS和AXOS的混合物（图2B和3B）。水解之后无法显著检测到游离的阿拉伯糖（图3B），这表明这种酶不能水解黑麦粉阿糖基木聚糖上的阿拉伯糖侧链。相反，一些阿拉伯糖在温度升高时得到释放。根据木糖在水解数据时程（图3）的形成，选择4 h作为生长试验制备水解底物的反应时间。
用HPAEC-PAD方法对生长试验中4 h水解产物的每一部分的寡糖数量（表1）进行分析。在水解的桦木木聚糖中，XOS的总含量为20 %，而水解的黑麦粉阿糖基木聚糖中，XOS的总含量为3.3 %；然而，由于缺乏标准，被阿拉伯糖取代的AXOS（图2B）还没有进行量化。这意味着，水解的黑麦粉阿糖基木聚糖中的寡糖总含量被低估。
选择比该酶最高活性的温度低10 ℃，可以使水解进行数小时而不会使酶的失活（图1），结果产生较低的酶量，将有助于降低该工艺的成本。
例如，产生的水解产物与先前报道的寡糖组成一致，寡糖是来自棘孢曲霉的木聚糖第10家族发生水解后获得的产物。因此，RmXyn10A专门水解木聚糖骨架，不会改变代替的阿拉伯糖残基。实际上，以前的研究表明，大多数木糖酶第10家族能攻击替代残基非还原端的木糖苷键，在替代残基之后使第3个木糖苷键分开。对RmXyn10来说，同一范围的还原糖从黑麦粉阿糖基木聚糖和桦木木聚糖获得，这表示酶在这两种底物中能以大致相同的程度到达木聚糖骨架，但来自桦木木聚糖的XOS产量较高，表明在很大程度上，这种底物包含非替代的木糖残基。使用RmXyn10A的另一个好处是水解过程中产生相对少量的单糖木糖。由于使用黑麦和桦木的木聚糖作底物，RmXyn10的两种变体FL和CM产生相似的产物和水解速度。RmXyn10A的CBM似乎对水解过程的结果不起作用。
2.3 XOS水解产物上精选的肠道细菌的生长
分批发酵实验的结果表明，XOS水解产物由青春双歧杆菌和短乳杆菌发酵，OD值上升，pH值下降，而未经处理的聚合木聚糖经任何菌株都无法发酵（表2），结果与以前的研究一致。在一项采用青春双歧杆菌相同菌株的研究中，XOS与葡萄糖相比生长更快，这是因为在其发酵实验中XOS的浓度更高。正如预料的那样，大肠标菌可发酵的既不是水解的木聚糖，也不是聚合木聚糖，证实了在XOS水解产物上通过大肠杆菌对益生菌菌株进行选择。大肠杆菌可发酵单糖阿拉伯糖和木糖，但尽管大肠杆菌无法在XOS水解产物上生长，因为阿拉伯糖和木糖都无法大量存在（表1）。所有用于测试发酵葡萄糖的菌株，用于正调节的碳源，以及小片球菌在其它任何碳源上都无法显著生长。 用HPAEC-PAD法在发酵48 h（图4和表4）后测定碳水化合物的利用，证实了表2的结果，青春双歧杆菌和短乳杆菌消耗水解木聚糖中的XOS，而小片球菌不消耗（表4）。
HPAEC-PAD分析的色谱图也表明，在用短乳杆菌和青春双歧杆菌水解黑麦粉阿基木聚糖时，AXOS发酵模式存在差异（图4B和D）。虽然两种菌株都使用非替代的XOS，但只有青春双歧杆菌使用阿拉伯糖替代的AXOS。青春双歧杆菌也能利用阿拉伯糖单糖，它不由短乳杆菌进行发酵（表3）。有趣的是，对短乳杆菌来说，木糖和XOS与葡萄糖相比，能促进生长达到更高的程度，而其它研究已表明，如果同时加入同一种混合物中，葡萄糖与木糖的发酵程度相同，或葡萄糖比木糖的发酵程度甚至更高。
有关小片球菌的基因组信息目前还无法获得。然而，对小片球菌属（乳酸片球菌、戊糖片球菌、克氏片球菌）现有的基因组的基因编码GHs进行筛选，表明以推测的方式给木聚糖酶或木糖苷酶进行编码的基因只存在于乳酸片球菌（GH3和GH43），这表明在这个种类的细菌中不利用XOS要比利用XOS更常见。
同样的结论对于乳酸杆菌来说也有效。以前进行的一项研究发现只有部分乳酸杆菌菌株利用XOS，据报道，除了现在研究中所使用的短乳杆菌之外，没有一种测试的乳酸杆菌在发酵期间利用XOS。我们的数据表明，黑麦水解产物（3.3 % XOS）和桦木水解产物（20 % XOS）中的短乳杆菌生长受到促进，但假定的AXOS组分没有得到利用。这些结果表明了分析的重要性，如果使用木聚糖，寡糖确实被试验的菌株所利用，因为以前曾经报道过短乳杆菌在含AXOS的水解产物上生长。然而，我们认为，以前研究中的短乳杆菌只利用XOS组分，据推测XOS也存在于水解产物中。然而，黑麦粉阿基木聚糖水解产物中的AXOS组分被青春双歧杆菌所利用，根据以前的论文，预计其也能在这种底物上生长。所使用的这两种底物之间的差异表明，非替代XOS要比AXOS更能促进更大范围的益生菌生长。
迄今为止，还没有短乳杆菌吸收XOS的模型，然而，双歧杆菌已计划了一种机制。预计青春双歧杆菌和动物双歧杆菌乳亚种能通过ATP结合盒转运载体（ATP-Binding Cassette transporter，ABC）型的糖类转运系统，将XOS（和AXOS）运送穿过细胞膜，这种系统能输入各种寡糖，寡糖进一步被胞内酶水解。源自青春双歧杆菌的相关特定酶似乎缺乏信号肽，这一事实证实了寡糖的细胞内水解。
至今，短乳杆菌中只有几种木聚糖降解酶具有特征，短乳杆菌中的AXOS不发生水解还没有立刻得到确认，因为基因组中存在假定能编码木聚糖酶/木糖苷酶（GH3和GH43）和阿拉伯呋喃糖酶（GH51）编码基因。然而，专业化的确认需要基因产物的特点，因为GH3和GH43中的单个酶的活性情况可能各不相同。目前，只能推测短乳杆菌中的AXOS没有得到利用可能是吸收系统差异的结果，也可能是短乳杆菌的底物专一性所致。对短乳杆菌中的GH进一步研究对于解释其低聚木糖发酵能力是个有趣的课题。□□
原题名：Xylooligosaccharides from Hardwood and Cereal Xylans Produced by a Thermostable Xylanase as Carbon Sources for Lactobacillus brevis and Bifidobacterium adolescentis（英文）
原作者：Peter Falck、Suthsiri Precha-Atsawanan和Carl Grey等（瑞士隆德大学化学系）
关键词：黑麦阿拉伯木聚糖；GH10木聚糖酶；短乳杆菌；青春双歧杆菌；低聚木糖
中图分类号：S816.75 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2014）02-0008-06
由于生物质在能源、化学品和食品生产领域中的未来需求，生物质利用是现今人们普遍关注的话题。因此，令人感兴趣的是开发相差技术来改善目前对生物质资源利用不充分的现状，如半纤维素。木聚糖是半纤维素最常见的类型，是由线性β-1，4-木糖主链和不同程度的短侧链构成的非均质聚合物；其结构和成分因植物的来源、部位、年龄以及其纯化加工方法的不同而各异。硬木所含的主要半纤维素几乎相同，为O-乙酰基-4-O-甲基葡萄糖醛酸-β-D-木聚糖，有时也称为甲基葡萄糖醛酸木聚糖（acetylglucuronoxylan）。来自草类植物（含谷物）的异质木聚糖具有与β-1，4-木糖残基相同的主链，但通常有更多分支。此外，该侧链含有大量的L-阿拉伯糖残基，它可能与其它糖类同时出现，如木糖和半乳糖，或与阿魏酸或香豆酸同时出现。这些取代基随机出现在聚合物中，使未被取代的木聚糖向外扩展。在评估木聚糖加工对环境的影响时，较之化学试剂而言，由于控制催化作用可行，因此，木聚糖酶发生酶片断化更有利于环境，能限制副产品的形成，无需使用刺激性化学品，符合绿色化学前景。木聚糖酶属于糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GH），由于其通常易于处理，且无需辅因子，因而在工业上极具吸引力。木聚糖酶（EC 3.2.1.8）可根据不同的GH家族进行分类，如GH5、GH7、GH8、GH10、GH11、GH43，取决于不同酶的序列和结构相似度。GH10和GH11由具有内切-1，4-β木聚糖酶活性的酶支配，能对主链中1，4-β-D-木糖苷键的随机水解进行催化。包括GH43在内的一些GH家族还聚集着外作用酶，如木糖苷酶（EC 3.2.1.37），能在木聚糖聚合物的非还原端对末端的木糖残基进行连续水解，或在GH8中发现的外木聚糖酶（EC 3.2.1 0.156），能对除去低聚木聚糖还原端的终端木糖进行催化。以往的研究表明，木聚糖酶携带的碳水化合物结合模块（Carbohydrate-Binding Module，CBM）能对木质纤维素底物的水解产生显著影响，可能依赖于酶和底物的种类和复杂程度。为了获得低聚糖，只有内切木聚糖酶才合适，因为它们对木聚糖聚合物更随机的作用将产生多种低聚糖产物。如果该作用在高于室温的环境下进行，耐热木聚糖内切酶能得到使用。酶解反应在较高的温度下进行有许多好处，因为这样的反应条件会提高底物的溶解性，降低其粘度，如果考虑处理工艺，这样做也能减少酶处理步骤之前的冷却成本，并减少处理时微生物污染的风险。由于高温能促进酶渗透和细胞壁的降解，因此，耐热酶的变体在处理农作物或原木等资源时具有优势。
在对谷物木聚糖，尤其是来自小麦的那些木聚糖，进行水解处理时产生的阿拉伯木寡糖（AXOS）和低聚木糖（XOS），最近已作为新的不易消化的低聚糖得到研究。这些低聚糖已得到广泛的评估，且安全可食用，并通过动物和人的试验证实对健康有益。通过实验室条件和自然条件下的发酵实验，多项研究证实它们具有益生元功能，表明低聚糖的发酵促进了益生菌的生长速度。
益生菌是一种进入结肠中存活的微生物，它们在结肠中发挥出对宿主健康有益的作用，并已证明通过提高抗菌物质的分泌来平衡肠道菌群，以调节宿主的免疫系统。乳酸杆菌和双歧杆菌被公认为是益生菌的代表菌种。它们的存在能抑制不需要或有害的（病原）细菌，减少许多结肠疾病的风险，如炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）、急性溃疡性结肠炎和节段性回肠炎（克罗恩氏病，Crohn’s disease）。此外，据称，动物总体健康状况受结肠健康状态的影响。最近的多项研究表明，乳酸杆菌和双歧杆菌的优选菌株能发酵源自木聚糖的寡糖。如果青春双歧杆菌在XOS上的生长速度高于在构成的单糖木糖上的速度，那就证明低聚木糖对青春双歧杆菌有巨大的生长促进作用。许多研究表明，双歧杆菌还能利用AXOS，并且能切割阿拉伯糖侧链的数种酶已得到鉴定。然而，仍不清楚的是某些乳酸杆菌菌种是否真的能发酵AXOS。人们对鉴定利用XOS的乳酸菌新菌株和找到生产XOS的新办法仍感兴趣。在进行生长研究时，并没有很多研究对从复杂的水解混合物中吸收单个低聚糖进行分析。
在这项研究中，源自硬木（桦木）和谷物（黑麦）的两种木聚糖模型被用作利用耐热聚糖酶（RmXyn10A）进行酶解反应的底物，以获取一系列的低聚木糖。这些原料用GH10家族的RmXyn10A进行处理，在温度高于80 ℃产生活性，分别从硬木和谷物的木聚糖中获得XOS和AXOS。该木聚糖酶的两个变体被作为水解的生物催化剂进行评估：一个变体由2个主要结合木聚糖的CBMs在内的5个模块组成，构成完整原酶长度，另一个变体组成了该酶的独立催化模块（Catalytic Module，CM）。酶处理后得到的水解产物被用作生长试验的碳源。如上所述，AXOS被认为具有益生元的功能，而源自硬木的木聚糖酶的水解产物XOS较少得到研究。本研究中用于测试水解产物生长情况的三种益生菌/假定性益生元菌菌株分别为小片球菌、青春双歧杆菌和短乳杆菌。根据假定性促健康型乳酸菌胞外多糖的生成，以及人类服用含有小片球菌和双岐杆菌属菌种协调细胞培养物的燕麦奶后表现出胆固醇降低的情况选择小片球菌2.6。病原菌对照实验组还使用了肠道菌群中不太受欢迎的细菌——大肠杆菌。 1 原料与方法
1.1 耐热木聚糖酶的制备
来自海洋红嗜热盐菌的木聚糖酶Xyn10A和来自相同酶的独立催化模块（CM），其生产方法是利用大肠杆菌BL21（DE3）在添加了氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中进行分批培养，并在对数中期阶段用IPTG进行诱导。细胞颗粒在结合缓冲液中再次悬浮，并在5 min的间隔按5×5 min的方法用超声波在冰上进行裂解。裂解细胞在20 min内在离心力5 500 g下的离心，然后用70 ℃水浴进行热处理30 min，部分纯化耐热木聚糖酶。正如其它文章介绍的那样，热处理后，含有组氨酸标记的木聚糖酶的上清液，用固定化金属离子亲和层析法进行纯化。咪唑则作为洗脱缓冲液。洗脱的蛋白在20 mM磷酸钠缓冲液、pH值为7.5、气温为4 ℃的情况下进行夜间透析（20 kDa）。木聚糖溶液的纯度用SDS-PAGE（瑞典Bio-Rad公司）和12.5 %的丙烯酰胺进行测定。木聚糖酶的总浓度和酶活性在报告条件下用二喹啉蛋白测定法（德国Sigma公司）和二硝基水杨酸阻止法进行测定。按照含1 %木聚糖的20 mM、pH 7.5的磷酸钠缓冲溶液中规定浓度的木糖标准，根据标准曲线对木聚糖酶的活性进行评估。木聚糖酶的活性以每摩尔木聚糖酶释放还原木糖残基[katal（mol/s）]表示。
1.2 木聚糖和阿拉伯木聚糖的水解
来自桦木X 0502（德国Sigma公司）的木聚糖含90 %以上的木糖，来自黑麦粉 P-RAXY（爱尔兰Megazyme公司）含90 %的碳水化合物（阿拉伯糖38 %、木糖59 %、3 %其它糖），经纯净的木聚糖内切酶变体水解。利用溶解在pH 7.5磷酸钠缓冲液、浓度为10 g/L的桦木木聚糖或黑麦粉阿拉伯木聚糖中60 nM木聚糖酶，在70 ℃活跃状态下进行水解反应的计时研究。反应结束后在头6 h内按2 h的时间间隔进行采样，24 h后再进行一次采样。采集的样本按下文的HPAEC-PAD法进行分析。用于分批培养实验的XOS水解物用相同的方法准备，但须在超纯水（Milli-Q）中进行，这样，反应在4 h后终止。为了中止木聚糖内切酶的活性，立即将样本浸入沸水30 min，并在室温下进行冷却，然后将它们注入圆底烧瓶进行冷冻干燥。
1.3 水解的木聚糖和阿拉伯木聚糖的分析
水解的桦木木聚糖和黑麦阿拉伯基木聚糖中的寡糖，用高效阴离子交换色谱—脉冲安培检测法（High-Performance Anion Exchange Chromatography With Pulsed Amperometric Detection，HPAEC-PAD）进行分析：使用同材料内径250 mm×4 min，8.5 μm的CarboPac PA100柱和同材料50 mm×4 mm（美国Dionex公司）的保护柱，恒定100 mM NaOH的流动相（1 mL/min），10～160 mM和160～400 mM的梯度醋酸钠溶液0～20 min和20～ 25 min。阿拉伯糖（瑞士Fluka公司）、木糖（德国Merck公司）、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖（Megazyme公司）的样品使用10 μL注射剂来确定色谱的峰值。在分析和与这些样品进行比较前用超纯水稀释。
1.4 细菌菌株和生长介质
用于测试水解木聚糖发酵能力的细菌菌株是青春双歧杆菌ATCC15703、短乳杆菌DSMZ1264、小片球菌2.6和大肠杆菌BL21（美国Novagen公司）。青春双歧杆菌、短乳杆菌、小片球菌和大肠杆菌都是用葡萄糖作为碳源进行两次预培养。
青春型双歧杆菌在37 ℃下接种于双歧杆菌媒介中。该媒介含12.5 g酪蛋白胨、胰蛋白酶消化液、6.25 g酵母抽提物、6.25 g肉汁、6.25 g细菌大豆胨、2.5 g的K2PO4、0.25 g的MgSO4·7H2O、0.0 625 g的MnSO4·H2O、6.25 g的NaCL氯化钠和每升含1.25 mL吐温80。向此溶液中加入5 mL刃天青（25 mg/100 mL）溶液和50 mL盐水，盐水中含有0.25 g的CaCl2·H2O，0.5 g的MgSO4·7H2O，1 g的KH2PO4，10 g的NaHCO3，2 g的NaCl。随后将该媒介煮沸，并在N 2气体中冷却。加入半胱氨酸，浓度达到0.625 g/L，并用NaOH调节到pH 6.8。
在37 ℃的厌氧条件下，短乳杆菌大MRS液体培养基（pH 6.7）中厌氧培养。
在30 ℃下，小片球菌大MRS培养基（pH 5.2）厌氧培养。在这种情况下，接种培养物在红霉素存在的情况下生长，维持胞外多糖制备质粒（EPS质粒）。
大肠杆菌首先在LB琼脂培养基上划线接种，并在37 ℃下培养。随后，单菌落转移到以葡萄糖为碳源的新鲜mAT培养基中，并在37 ℃下进行有氧培养。然后，细胞转移到新鲜mAT培养基中，当细胞已经达到早期稳定期时，它们在不同的碳源条件下于37 ℃进行厌氧培养。
相应的碳源——阿拉伯糖、葡萄糖和木糖为过滤器，通过0.22 μm过滤器进行杀菌，而黑麦阿拉伯木聚糖（RAX）、水解的黑麦阿拉伯木聚糖（H-RAX）、桦木木聚糖（BX）和水解的桦木木聚糖（H-BX）在121 ℃下 分别进行15 min的高压灭菌。在培养开始时，将无菌碳源加入到相应的培养基中，根据总糖或水解产物浓度，以5 mg/mL的浓度进行无碳源制备。对所有菌株而言，无碳源的介质还用于阴性对照。
培养试验的所有介质——肉汁和琼脂，在121 ℃经15 min的高压灭菌。所有用于厌氧生长的培养介质将含有氮气的厌氧管伸入介质中取代其中的氧气而进行脱氧气。然后，所有将厌氧管用金属瓶盖封闭，并在121 ℃下经15 min高压灭菌。随后，在用于实验前将它们在4 ℃下保存。 1.5 分批发酵试验
青春双歧杆菌、短乳杆菌和小片球菌分别在各自的培养基中预接种24 h，大肠杆菌则预接种7 h，然后将培养物转移到新鲜的培养基中进行厌氧分批发酵试验。接种培养基中的细胞颗粒，以3 200 g的离心力离心15 min，进行收集，随后用0.9 %的盐水漂洗2次。
接种物占总体积的2 %（体积/体积），但小片球菌除外，后者占培养物的4 %（体积/体积）。青春双歧杆菌、短乳杆菌和大肠杆菌的厌氧培养在37 ℃下培养72 h，而小片球菌则在30 ℃下培养72 h，此温度是这种菌株的最佳生长温度。每一个发酵试验中，每一种碳源均用两根试管，其中一根试管是对照试管，不含碳源。每根试管的总容积为10 mL：8 mL为制备的培养基，2 mL为加入的碳水化合物底物或作为对照的无菌水。
细胞培养物在72 h内以每隔24 h的间隔进行采样，对其生长、pH值和碳源的利用情况进行分析。细胞密度作为细菌生长的量度标准，通过在620 nm处测量光密度（OD）来确定。分别取200 μL青春双歧杆菌、短乳杆菌和大肠杆菌培养物的样本，用一块微量培养板测定它们的生长情况，而小片球菌则用Biowave Ⅱ紫外-可见分光光度计（英国Biochrom公司）和一个1 mL的小玻璃管测定其生长速度。倍比稀释和总平板计数（CFU/mL）用来确认72 h时的小片球菌生长量。测定pH值以评估培养基中的产酸量。细菌在不同碳水化合物来源条件下的碳水化合物利用能力用HPAEC-PAD测定。
2 结果和讨论
2.1 木聚糖酶活性测定
RmXyn10A是一种模块化的GH10木聚糖酶，源自海洋红嗜热盐菌。纯合的RmXyn10A变体FL，即全长酶和CM，也就是说是一个带有唯一催化模块的构建体，首次得到了分析，以比较它们活性的最佳值，以及在桦木木聚糖和黑麦粉阿拉伯木聚糖底物上的特殊活性。
以桦木木聚糖为底物，对该木聚糖酶变体在pH 7.5的最佳温度下进行测定。根据先前仅使用催化模块进行测定的结果，RmXyn10A的全长和催化模块产生活性的最佳温度为80 ℃（图1）。
之前的热失活实验表明，该催化模块在此温度下半衰期为100 min，而在70 ℃下24 h内完全稳定。为了用木聚糖底物进行长时间培养且不会丧失活性，本试验决定在70 ℃进行。此外，据证实，灭活该酶的所用方法已得到证实，本试验中是CM，在木聚糖（煮沸30 min，然后高压灭菌）水解后，导致酶完全失活。在煮沸后，酶的活性约残留15 %，而高压灭菌使木聚糖酶完全灭活。
对硬木木聚糖和谷物阿拉伯木聚糖的特殊活性在全长酶（FL）和70 ℃时的CM进行测定，结果在两个底物上处于相同的范围。全长酶的活性略高（桦木木聚糖为106±3 kat/mol，黑麦粉阿拉伯木聚糖为109±3 kat/mol），而CM的活性略低（桦木木聚糖为71±2 kat/mol，黑麦粉阿拉伯木聚糖为93±3 kat/mol）。然而，不同底物的活性差异很小，表明在FL上的CBMs作用有限。尽管FL的活性略高，我们决定继续只研究CM，因为CM更容易生产，并具有较高的热稳定性。
2.2 水解产物的组成和XOS水解物的制备
CM和FL在低程度的聚合作用（DP）范围（未给出数据）内会产生相同的水解产物模式，刺激持续使用唯一的一种酶变体。下一个试验只使用CM。
因此，使用两种浓度的CM进行时间进程研究，以监控寡糖的产生。如图2A和3A所示，木四糖（X4）和木五糖（X5）首先形成，随后进一步降解成木三糖（X3）、木二糖（X2）和木糖（X）。
这表明，X2是桦木木聚糖水解的最终产物，X3、X2和X缓慢降解产生有限的X，这一结果与先前对该酶的研究数据一致，表明可水解的最小XOS底物为X3。值得注意的还有图2A中12～15 min的峰值，这很可能是XOS被4-O-甲基葡萄糖醛酸取代的结果。黑麦粉阿拉伯木聚糖被水解成XOS和AXOS的混合物（图2B和3B）。水解之后无法显著检测到游离的阿拉伯糖（图3B），这表明这种酶不能水解黑麦粉阿糖基木聚糖上的阿拉伯糖侧链。相反，一些阿拉伯糖在温度升高时得到释放。根据木糖在水解数据时程（图3）的形成，选择4 h作为生长试验制备水解底物的反应时间。
用HPAEC-PAD方法对生长试验中4 h水解产物的每一部分的寡糖数量（表1）进行分析。在水解的桦木木聚糖中，XOS的总含量为20 %，而水解的黑麦粉阿糖基木聚糖中，XOS的总含量为3.3 %；然而，由于缺乏标准，被阿拉伯糖取代的AXOS（图2B）还没有进行量化。这意味着，水解的黑麦粉阿糖基木聚糖中的寡糖总含量被低估。
选择比该酶最高活性的温度低10 ℃，可以使水解进行数小时而不会使酶的失活（图1），结果产生较低的酶量，将有助于降低该工艺的成本。
例如，产生的水解产物与先前报道的寡糖组成一致，寡糖是来自棘孢曲霉的木聚糖第10家族发生水解后获得的产物。因此，RmXyn10A专门水解木聚糖骨架，不会改变代替的阿拉伯糖残基。实际上，以前的研究表明，大多数木糖酶第10家族能攻击替代残基非还原端的木糖苷键，在替代残基之后使第3个木糖苷键分开。对RmXyn10来说，同一范围的还原糖从黑麦粉阿糖基木聚糖和桦木木聚糖获得，这表示酶在这两种底物中能以大致相同的程度到达木聚糖骨架，但来自桦木木聚糖的XOS产量较高，表明在很大程度上，这种底物包含非替代的木糖残基。使用RmXyn10A的另一个好处是水解过程中产生相对少量的单糖木糖。由于使用黑麦和桦木的木聚糖作底物，RmXyn10的两种变体FL和CM产生相似的产物和水解速度。RmXyn10A的CBM似乎对水解过程的结果不起作用。
2.3 XOS水解产物上精选的肠道细菌的生长
分批发酵实验的结果表明，XOS水解产物由青春双歧杆菌和短乳杆菌发酵，OD值上升，pH值下降，而未经处理的聚合木聚糖经任何菌株都无法发酵（表2），结果与以前的研究一致。在一项采用青春双歧杆菌相同菌株的研究中，XOS与葡萄糖相比生长更快，这是因为在其发酵实验中XOS的浓度更高。正如预料的那样，大肠标菌可发酵的既不是水解的木聚糖，也不是聚合木聚糖，证实了在XOS水解产物上通过大肠杆菌对益生菌菌株进行选择。大肠杆菌可发酵单糖阿拉伯糖和木糖，但尽管大肠杆菌无法在XOS水解产物上生长，因为阿拉伯糖和木糖都无法大量存在（表1）。所有用于测试发酵葡萄糖的菌株，用于正调节的碳源，以及小片球菌在其它任何碳源上都无法显著生长。 用HPAEC-PAD法在发酵48 h（图4和表4）后测定碳水化合物的利用，证实了表2的结果，青春双歧杆菌和短乳杆菌消耗水解木聚糖中的XOS，而小片球菌不消耗（表4）。
HPAEC-PAD分析的色谱图也表明，在用短乳杆菌和青春双歧杆菌水解黑麦粉阿基木聚糖时，AXOS发酵模式存在差异（图4B和D）。虽然两种菌株都使用非替代的XOS，但只有青春双歧杆菌使用阿拉伯糖替代的AXOS。青春双歧杆菌也能利用阿拉伯糖单糖，它不由短乳杆菌进行发酵（表3）。有趣的是，对短乳杆菌来说，木糖和XOS与葡萄糖相比，能促进生长达到更高的程度，而其它研究已表明，如果同时加入同一种混合物中，葡萄糖与木糖的发酵程度相同，或葡萄糖比木糖的发酵程度甚至更高。
有关小片球菌的基因组信息目前还无法获得。然而，对小片球菌属（乳酸片球菌、戊糖片球菌、克氏片球菌）现有的基因组的基因编码GHs进行筛选，表明以推测的方式给木聚糖酶或木糖苷酶进行编码的基因只存在于乳酸片球菌（GH3和GH43），这表明在这个种类的细菌中不利用XOS要比利用XOS更常见。
同样的结论对于乳酸杆菌来说也有效。以前进行的一项研究发现只有部分乳酸杆菌菌株利用XOS，据报道，除了现在研究中所使用的短乳杆菌之外，没有一种测试的乳酸杆菌在发酵期间利用XOS。我们的数据表明，黑麦水解产物（3.3 % XOS）和桦木水解产物（20 % XOS）中的短乳杆菌生长受到促进，但假定的AXOS组分没有得到利用。这些结果表明了分析的重要性，如果使用木聚糖，寡糖确实被试验的菌株所利用，因为以前曾经报道过短乳杆菌在含AXOS的水解产物上生长。然而，我们认为，以前研究中的短乳杆菌只利用XOS组分，据推测XOS也存在于水解产物中。然而，黑麦粉阿基木聚糖水解产物中的AXOS组分被青春双歧杆菌所利用，根据以前的论文，预计其也能在这种底物上生长。所使用的这两种底物之间的差异表明，非替代XOS要比AXOS更能促进更大范围的益生菌生长。
迄今为止，还没有短乳杆菌吸收XOS的模型，然而，双歧杆菌已计划了一种机制。预计青春双歧杆菌和动物双歧杆菌乳亚种能通过ATP结合盒转运载体（ATP-Binding Cassette transporter，ABC）型的糖类转运系统，将XOS（和AXOS）运送穿过细胞膜，这种系统能输入各种寡糖，寡糖进一步被胞内酶水解。源自青春双歧杆菌的相关特定酶似乎缺乏信号肽，这一事实证实了寡糖的细胞内水解。
至今，短乳杆菌中只有几种木聚糖降解酶具有特征，短乳杆菌中的AXOS不发生水解还没有立刻得到确认，因为基因组中存在假定能编码木聚糖酶/木糖苷酶（GH3和GH43）和阿拉伯呋喃糖酶（GH51）编码基因。然而，专业化的确认需要基因产物的特点，因为GH3和GH43中的单个酶的活性情况可能各不相同。目前，只能推测短乳杆菌中的AXOS没有得到利用可能是吸收系统差异的结果，也可能是短乳杆菌的底物专一性所致。对短乳杆菌中的GH进一步研究对于解释其低聚木糖发酵能力是个有趣的课题。□□
原题名：Xylooligosaccharides from Hardwood and Cereal Xylans Produced by a Thermostable Xylanase as Carbon Sources for Lactobacillus brevis and Bifidobacterium adolescentis（英文）
原作者：Peter Falck、Suthsiri Precha-Atsawanan和Carl Grey等（瑞士隆德大学化学系）