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摘要：目的 观察一氧化氮（NO）信号通路及胃泌素（GAS）水平在大鼠脾气虚证进程中的变化及益气健脾中药的干预效应。方法 将受试动物随机分为正常组、模型组（7、14、21 d组）、益气健脾组，每组10只。采用大黄法、力竭法及饥饿法复合建立脾气虚证大鼠模型，分时段测定各组大鼠胃肠组织、血清一氧化氮合酶（NOS）、NO、GAS动态表达水平。结果 与正常对照组比较，模型大鼠胃肠组织及血清NOS、NO、GAS水平逐渐降低（P<0.05，P<0.01），且以21 d组显著，而益气健脾组大鼠NOS、NO、GAS水平未见明显变化，且与模型21 d组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 NO、NOS、GAS在脾气虚的形成过程中主要以低水平表达为主，而益气健脾中药具有促进NO信号通路及GAS表达的作用。
关键词：脾气虚；一氧化氮；一氧化氮合酶；胃泌素；益气健脾中药；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0027-02
Effect of Yiqi Jianpi Herbs on Variation of Nitric Oxide Signal Pathway and Gastrin Expression in Spleen-qi Deficiency Rats CHENG Ying-xia1，2， CHENG Rong1， DUAN Yong-qiang1， LEI Zuo-han3， LI Lan-zhen1， ZHU Li-ming1 （1.Gansu College of TCM， Lanzhou 730020， China；2.Nurturing Station of Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for TCM of Gansu Province， Lanzhou 730020， China；3.Institute of Integrated Chinese and Western Medicine， School of Basic Medical Sciences， Lanzhou University， Lanzhou 7300020， China；4.Gansu Provincial Hospital of TCM， Lanzhou 730050， China）
Abstract：Objective To investigate the dynamic changes of nitric oxide signal pathway and gastrin （GAS） expression in spleen-qi deficiency rats and effect of Yiqi Jianpi herbs. Methods Rats were randomly divided into 5 groups：normal control group， model group （observed on 7， 14 and 21 d）， and Yiqi Jianpi herb group， 10 rats in each group. The spleen qi deficiency model rats were made by rhubarb， exhaustive and hungry method， and treatment group was treated with Yiqi Jianpi herbs. Nitric oxide signal pathway and GAS expression of rats were evaluated on 7， 14 and 21 d. Results In model group， levels of NOS， NO and GAS were much lower than that of normal control group （P<0.05， P<0.01）， and was obvious in 21 d group. NOS， NO and GAS of Yiqi Jianpi herb group had no significant changes， and were much higher than that of model 21 d group （P<0.05）. Conclusion The nitric oxide signal pathway and GAS expression in spleen-qi deficiency are mainly low-level expression and Yiqi Jianpi herbs has the function of elevating the expression of NOS， NO and GAS.
Key words：spleen-qi deficiency；NO；NOS；gastrin；Yiqi Jianpi herb；rats
研究表明一氧化氮合酶（NOS）广泛分布于胃肠道，其产物一氧化氮（NO）是非肾上腺素能非胆碱能神经的抑制性递质，广泛参与胃肠生理功能。NO不仅在神经传导、胃肠保护中起重要作用，而且参与多种病理发生的信号转导[1]。胃泌素（GAS）属胃肠激素，分布于中枢神经系统和胃肠道黏膜组织，在外周作为激素调节胃的运动功能，属兴奋胃肠运动的脑肠肽之一[2]。
基金项目：国家自然科学基金（81160420）；甘肃省自然科学基金（1010RJZA148）；甘肃省教育厅基金（0706B-02）
通讯作者：段永强，E-mail：[email protected] 而中医脾虚证出现如纳呆、腹胀、大便溏结不调等症状均为胃肠道生理功能紊乱所致，故本课题以脾气虚证大鼠为对象，研究一氧化氮信号通路及GAS表达水平在脾气虚证进程中的动态变化以及益气健脾中药的干预效应，以期揭示脾气虚证发生的内在机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，3月龄，体质量（180±20）g，甘肃中医学院医学实验中心提供，动物合格证号SCXK[甘] 2011-0001-0001011；实验设施合格证SYXK[甘]2011-0001- 0000314。
1.2 药物与试剂
中药均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司。益气健脾中药（四君子汤）以人参、白术、茯苓、甘草按3∶3∶3∶2比例配制，加10倍量蒸馏水浸泡4 h，按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液，置70～80 ℃水浴浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，冷却后置4 ℃冰箱备用，使用时稀释至所需浓度。大黄制剂：将生大黄饮片碎成粉，用蒸馏水浸泡，置于50 ℃水浴6 h，去渣取汁4 ℃保存。
考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号20101214）、NO测试盒（批号20101215）、NOS测试盒（批号20101216），南京建成医学生物研究所产品；GAS放免试剂盒（批号20101221），北京北方生物技术研究所产品。
1.3 主要仪器
DF110型电子分析天平，721型可见光分光光度计，HH-4数显恒温水浴箱， XYJ80-2离心机，FT-630 g微机多探头γ计数器，KDC-2044低速冷冻离心机。
2 实验方法
2.1 分组与造模
适应性饲养1周后，受试动物按体质量编号，用随机数字表法[3]分为正常对照组、模型组（7、14、21 d）、益气健脾组，每组10只，雌雄各半分笼饲养。参考文献[4]方法，以大黄法、力竭法及饥饿法三因素复合法复制脾气虚证模型，共21 d。
2.2 给药
造模同时益气健脾组给予益气健脾中药灌胃给药干预，灌胃剂量20 g/（kg·d），灌胃容积为1 mL/100 g体质量，连续3周；空白对照组、模型组给予同体积蒸馏水灌胃。各组均以蒸馏水、标准饲料喂养。
2.3 标本采集与检测
造模时分别于第7、14、21日末取材并制备待检样本。各组大鼠于末次灌胃给药后，禁食不禁水24 h，测体质量作记录，采血后断头处死并制备待检标本。
血清制备：股动脉取血4 mL，静置2 h后，2 000 r/min离心10 min，取上清，放入尖底管中4 ℃低温冰箱保存待测，一部分采用比色法检测NO、NOS，一部分采用放免法检测GAS。
胃、小肠组织的收集：动物处死后，迅速将近胃小弯胃组织、胃窦端小肠组织截取，称重后分别用眼科小剪刀尽快剪碎，分别置于匀浆器中，用组织重9倍生理盐水匀浆（匀浆器的末端置于放冰块的冷水中），后以3 500 r/min离心10 min，取上清液置4 ℃冰箱保存，其中胃、小肠组织匀浆上清液一部分采用比色法检测NO、NOS，胃组织匀浆一部分采用放免法检测GAS。
3 统计学方法
采用SPSS13.0软件进行统计分析，实验数据以—x±s表示，组间样本均数差异的比较选用F检验，在F检验有统计学意义时，再用q检验进行两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
正常对照组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及饮食量正常，被毛浓密柔顺而有光泽，粪便呈棕褐色颗粒状。模型组大鼠多数在第5日即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯；第10日后出现少食、怠动、消瘦、肛周污秽，部分动物出现脱肛，动作迟缓，甚至行动歪斜，同时毛发失去正常光泽而枯槁、疏散，而后出现畏寒，成群蜷缩或拱背，并逐渐出现体质量减轻，大便增多（垫料呈橘黄色）等脾虚症状。益气健脾组大鼠第6日出现轻度倦卧、被毛稀疏干枯；第13日后出现少食、怠动、消瘦、肛周污秽，少部分动物出现脱肛，动作迟缓，大便增多等；第16日后上述症状开始减轻或消失，表现为反应较为灵敏，活动及饮食量正常，被毛疏散但有光泽，粪便部分呈颗粒状。
4.2 益气健脾中药对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮含量的影响（见表1）
4.3 益气健脾中药对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮合酶含量的影响（见表2）
4.4 益气健脾中药对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织胃泌素含量的影响（见表3）
5 讨论
脾虚证作为一种全身性的病理状态存在着胃肠道运动功能紊乱，消化吸收功能下降，淀粉酶活性下降及其化学消化能力低下，胃排空加速，小肠吸收功能下降；同时胃肠道内分泌及激素异常，餐后血清GAS明显降低，G细胞合成分泌功能减弱[4]，由此提示脾虚证的发生可能有细胞信号转导通路的参与。四君子汤是益气健脾法的代表方剂，方中人参性甘大补脾胃之气为君；白术苦温，助君药燥湿健脾；茯苓甘淡健脾、渗湿利水；炙甘草味甘性微温，和中益气。
关键词：脾气虚；一氧化氮；一氧化氮合酶；胃泌素；益气健脾中药；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0027-02
Effect of Yiqi Jianpi Herbs on Variation of Nitric Oxide Signal Pathway and Gastrin Expression in Spleen-qi Deficiency Rats CHENG Ying-xia1，2， CHENG Rong1， DUAN Yong-qiang1， LEI Zuo-han3， LI Lan-zhen1， ZHU Li-ming1 （1.Gansu College of TCM， Lanzhou 730020， China；2.Nurturing Station of Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for TCM of Gansu Province， Lanzhou 730020， China；3.Institute of Integrated Chinese and Western Medicine， School of Basic Medical Sciences， Lanzhou University， Lanzhou 7300020， China；4.Gansu Provincial Hospital of TCM， Lanzhou 730050， China）
Abstract：Objective To investigate the dynamic changes of nitric oxide signal pathway and gastrin （GAS） expression in spleen-qi deficiency rats and effect of Yiqi Jianpi herbs. Methods Rats were randomly divided into 5 groups：normal control group， model group （observed on 7， 14 and 21 d）， and Yiqi Jianpi herb group， 10 rats in each group. The spleen qi deficiency model rats were made by rhubarb， exhaustive and hungry method， and treatment group was treated with Yiqi Jianpi herbs. Nitric oxide signal pathway and GAS expression of rats were evaluated on 7， 14 and 21 d. Results In model group， levels of NOS， NO and GAS were much lower than that of normal control group （P<0.05， P<0.01）， and was obvious in 21 d group. NOS， NO and GAS of Yiqi Jianpi herb group had no significant changes， and were much higher than that of model 21 d group （P<0.05）. Conclusion The nitric oxide signal pathway and GAS expression in spleen-qi deficiency are mainly low-level expression and Yiqi Jianpi herbs has the function of elevating the expression of NOS， NO and GAS.
Key words：spleen-qi deficiency；NO；NOS；gastrin；Yiqi Jianpi herb；rats
研究表明一氧化氮合酶（NOS）广泛分布于胃肠道，其产物一氧化氮（NO）是非肾上腺素能非胆碱能神经的抑制性递质，广泛参与胃肠生理功能。NO不仅在神经传导、胃肠保护中起重要作用，而且参与多种病理发生的信号转导[1]。胃泌素（GAS）属胃肠激素，分布于中枢神经系统和胃肠道黏膜组织，在外周作为激素调节胃的运动功能，属兴奋胃肠运动的脑肠肽之一[2]。
基金项目：国家自然科学基金（81160420）；甘肃省自然科学基金（1010RJZA148）；甘肃省教育厅基金（0706B-02）
通讯作者：段永强，E-mail：[email protected] 而中医脾虚证出现如纳呆、腹胀、大便溏结不调等症状均为胃肠道生理功能紊乱所致，故本课题以脾气虚证大鼠为对象，研究一氧化氮信号通路及GAS表达水平在脾气虚证进程中的动态变化以及益气健脾中药的干预效应，以期揭示脾气虚证发生的内在机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，3月龄，体质量（180±20）g，甘肃中医学院医学实验中心提供，动物合格证号SCXK[甘] 2011-0001-0001011；实验设施合格证SYXK[甘]2011-0001- 0000314。
1.2 药物与试剂
中药均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司。益气健脾中药（四君子汤）以人参、白术、茯苓、甘草按3∶3∶3∶2比例配制，加10倍量蒸馏水浸泡4 h，按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液，置70～80 ℃水浴浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，冷却后置4 ℃冰箱备用，使用时稀释至所需浓度。大黄制剂：将生大黄饮片碎成粉，用蒸馏水浸泡，置于50 ℃水浴6 h，去渣取汁4 ℃保存。
考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号20101214）、NO测试盒（批号20101215）、NOS测试盒（批号20101216），南京建成医学生物研究所产品；GAS放免试剂盒（批号20101221），北京北方生物技术研究所产品。
1.3 主要仪器
DF110型电子分析天平，721型可见光分光光度计，HH-4数显恒温水浴箱， XYJ80-2离心机，FT-630 g微机多探头γ计数器，KDC-2044低速冷冻离心机。
2 实验方法
2.1 分组与造模
适应性饲养1周后，受试动物按体质量编号，用随机数字表法[3]分为正常对照组、模型组（7、14、21 d）、益气健脾组，每组10只，雌雄各半分笼饲养。参考文献[4]方法，以大黄法、力竭法及饥饿法三因素复合法复制脾气虚证模型，共21 d。
2.2 给药
造模同时益气健脾组给予益气健脾中药灌胃给药干预，灌胃剂量20 g/（kg·d），灌胃容积为1 mL/100 g体质量，连续3周；空白对照组、模型组给予同体积蒸馏水灌胃。各组均以蒸馏水、标准饲料喂养。
2.3 标本采集与检测
造模时分别于第7、14、21日末取材并制备待检样本。各组大鼠于末次灌胃给药后，禁食不禁水24 h，测体质量作记录，采血后断头处死并制备待检标本。
血清制备：股动脉取血4 mL，静置2 h后，2 000 r/min离心10 min，取上清，放入尖底管中4 ℃低温冰箱保存待测，一部分采用比色法检测NO、NOS，一部分采用放免法检测GAS。
胃、小肠组织的收集：动物处死后，迅速将近胃小弯胃组织、胃窦端小肠组织截取，称重后分别用眼科小剪刀尽快剪碎，分别置于匀浆器中，用组织重9倍生理盐水匀浆（匀浆器的末端置于放冰块的冷水中），后以3 500 r/min离心10 min，取上清液置4 ℃冰箱保存，其中胃、小肠组织匀浆上清液一部分采用比色法检测NO、NOS，胃组织匀浆一部分采用放免法检测GAS。
3 统计学方法
采用SPSS13.0软件进行统计分析，实验数据以—x±s表示，组间样本均数差异的比较选用F检验，在F检验有统计学意义时，再用q检验进行两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
正常对照组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及饮食量正常，被毛浓密柔顺而有光泽，粪便呈棕褐色颗粒状。模型组大鼠多数在第5日即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯；第10日后出现少食、怠动、消瘦、肛周污秽，部分动物出现脱肛，动作迟缓，甚至行动歪斜，同时毛发失去正常光泽而枯槁、疏散，而后出现畏寒，成群蜷缩或拱背，并逐渐出现体质量减轻，大便增多（垫料呈橘黄色）等脾虚症状。益气健脾组大鼠第6日出现轻度倦卧、被毛稀疏干枯；第13日后出现少食、怠动、消瘦、肛周污秽，少部分动物出现脱肛，动作迟缓，大便增多等；第16日后上述症状开始减轻或消失，表现为反应较为灵敏，活动及饮食量正常，被毛疏散但有光泽，粪便部分呈颗粒状。
4.2 益气健脾中药对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮含量的影响（见表1）
4.3 益气健脾中药对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织一氧化氮合酶含量的影响（见表2）
4.4 益气健脾中药对脾气虚证大鼠血清及胃肠组织胃泌素含量的影响（见表3）
5 讨论
脾虚证作为一种全身性的病理状态存在着胃肠道运动功能紊乱，消化吸收功能下降，淀粉酶活性下降及其化学消化能力低下，胃排空加速，小肠吸收功能下降；同时胃肠道内分泌及激素异常，餐后血清GAS明显降低，G细胞合成分泌功能减弱[4]，由此提示脾虚证的发生可能有细胞信号转导通路的参与。四君子汤是益气健脾法的代表方剂，方中人参性甘大补脾胃之气为君；白术苦温，助君药燥湿健脾；茯苓甘淡健脾、渗湿利水；炙甘草味甘性微温，和中益气。