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摘要：目的 建立紫朱软膏的质量标准。方法 采用薄层色谱法对紫朱软膏中的紫草、冰片进行鉴别，采用气相色谱法测定制剂中冰片的含量。结果 薄层色谱中主斑点清晰，分离度好；冰片在0.048 4～1.210 0 μg范围内线性关系良好，加样回收率在90%～110%范围内，RSD<5%。结论 本方法简便可行，可用于紫朱软膏的质量控制。
关键词：紫朱软膏；紫草；冰片；薄层色谱法；气相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.029
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0095-03
Abstract：Objective To establish the quality standards of Zizhu ointment. Methods The TLC was applied to identify Radix arnebiae and borneol of Zizhu ointment， and the content of borneol was determined by gas chromatography. Results The TLC spots were clear， well-separated and easy to identify. The good linear range of borneol reference substance on calibration curve was 0.0484-1.2100 μg， and the recovery was 90%-110%， the relative standard deviation was less than 5%. Conclusion The method is simple and feasible， can be used as the quality control method of Zizhu ointment.
Key words：Zizhu ointment；Radix arnebiae；borneol；TLC；GC
紫朱软膏为上海中医药大学附属曙光医院院内制剂，由紫草、朱砂、冰片、黄芪、龙血竭、阿胶6味药组成，具有清热解毒、祛腐生肌、补气益血功效，临床主要用于糖尿病足的治疗。本研究采用现代外用制剂方法和技术，对医院制剂进行剂型改进，研制出油脂性和水溶性2种软膏，其中油脂性软膏以羊毛脂、白凡士林、聚乙二醇等为主要基质，水溶性软膏以水、泊洛沙姆、甘油、聚乙二醇类为主要基质。本试验采用薄层色谱法对2种软膏中的紫草和冰片进行定性鉴别，采用气相色谱法对冰片进行含量测定，建立可控制该制剂质量的标准。
1 仪器与试药
BS2202S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），BRANSON B5500S-MT超声清洗仪（必能信超声上海有限公司），Centrifuge 5810R离心机（eppendorf），旋转蒸发仪（BUCHI公司），CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER 4自动点样仪、CAMAG REPROSTAR 3拍照仪（瑞士卡玛公司），Molcell 1805v细胞型超纯水机（上海摩勒生物科技有限公司），安捷伦6890N气相色谱仪（美国安捷伦公司），XS 105型电子天平（METTLER TOLEDO），ZNHW-Ⅱ-500mL智能数显恒温电热套（巩义予华仪器厂）。硅胶G板（上海东方药品科技实业有限公司，批号20120120）。
硅藻土、甲醇、石油醚（60～90 ℃）、环己烷、乙酸乙酯、无水甲酸、氢氧化钾（上海凌峰化学试剂有限公司），中性氧化铝100～200目、甲苯、香兰素、硫酸（国药集团化学试剂有限公司），硅藻土为化学纯，中性氧化铝为柱层析用，其余均为分析纯。紫草对照药材（批号121430-200802）、冰片对照品（批号110743-200905）购自中国药品生物制品检定所，水杨酸甲酯（SIGMA公司，批号101164573），紫朱软膏、阴性样品均为实验室自制。
2 方法与结果
2.1 薄层色谱鉴别
2.1.1 紫草 称取油脂性紫朱软膏20 g，硅藻土30 g，于研钵中研磨。研匀后转移至锥形瓶中，加甲醇100 mL，超声提取20 min，离心后上清液过滤，滤液减压至干。残渣以石油醚（60～90 ℃）与水各30 mL少量多次交互洗涤后转移至分液漏斗中，静置分层，分取石油醚层，以水洗3遍，旋蒸浓缩至2 mL，以中性氧化铝（100～200目）3 g吸附，再用甲醇洗3遍，挥干甲醇后，加入环己烷-甲酸（100∶1）20 mL超声提取15 min，提取液离心过滤，滤液减压蒸干，残渣以石油醚1 mL溶解，即得供试品溶液。另取缺紫草的阴性油脂性紫朱软膏、水溶性紫朱软膏和缺紫草的阴性水溶性紫朱软膏各20 g，同法制备供试品溶液。再取紫草对照药材0.2 g，同法制成紫草对照药材溶液。照《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B[1]试验，吸取紫草对照药材溶液2 μL、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1）为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液至斑点显色。供试品色谱中，在与紫草对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝色的2个斑点，两阴性对照溶液均无干扰。
2.1.2 冰片 称取油脂性紫朱软膏10 g，加硅藻土15 g研磨，研匀后转移至500 mL圆底烧瓶，加水150 mL与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。置电热套中，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分并溢流入烧瓶时为止，再加甲苯2 mL，缓缓加热至沸腾，并保持微沸约3 h，静置1 h，待冷却后将挥发油测定器中的液体移至分液漏斗中，测定器用少量甲苯洗涤，分取甲苯层，另加乙酸乙酯适量，稀释至10 mL，离心后吸取上清液1 mL作为供试品溶液。另取缺冰片的阴性油脂性紫朱软膏、水溶性紫朱软膏和缺冰片的阴性水溶性紫朱软膏各10 g，同法制备供试品溶液。再取冰片对照药材1.00 mg加乙酸乙酯1 mL溶解，制成对照药材溶液。吸取对照药材溶液1 μL、供试品溶液及阴性对照溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-乙酸乙酯（10∶1∶2）为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰，置日光下观察。供试品色谱中，在与冰片对照药材色谱相应位置上，显2个相同紫红色斑点，两阴性对照溶液均无相应斑点。 2.3 冰片含量测定
2.3.1 对照品贮备液的制备 精密称取冰片对照品60.30 mg，于50 mL容量瓶，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含1.206 0 mg的溶液。
2.3.2 内标溶液的制备 精密称取水杨酸甲酯100.50 mg，于100 mL容量瓶，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含1.005 0 mg的溶液。
2.3.3 供试品溶液的制备 称取油脂性紫朱软膏5 g，加硅藻土7.5 g研磨，研匀后转移至500 mL圆底烧瓶，加水150 mL与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。置电热套中，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分并溢流入烧瓶时为止，再加甲苯2 mL，缓缓加热至沸腾，并保持微沸约3 h，静置1 h，待冷却后将挥发油测定器中的液体移至分液漏斗中，测定器用少量甲苯洗涤，分取甲苯层，另加乙酸乙酯适量，稀释至10 mL，离心后吸取上清溶液1 mL作为供试品溶液。另取缺冰片的阴性油脂性紫朱软膏、水溶性紫朱软膏和缺冰片的阴性水溶性紫朱软膏各5 g，同法制备供试品溶液。
2.3.4 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：HP INNOWAX毛细管色谱柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；氢火焰离子化检测器，载气N2压力为115.836 kPa、流速为3 mL/min，H2流速为45 mL/min，空气流速为400 mL/min，柱温120 ℃，进样口温度220 ℃，检测器温度250 ℃，分流比10∶1，N2尾吹流速为45 mL/min。
2.3.5 校正因子的计算 精密量取0.8、1.0、1.2 mL的冰片对照品贮备液，加入1.0 mL水杨酸甲酯内标溶液，于10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀。按上述色谱条件进样，计算校正因子。
2.3.6 专属性考察 分别精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液2.0 μL，注入气相色谱仪进行测定，阴性对照溶液均无干扰。水杨酸甲酯色谱峰与冰片色谱峰分离度良好，其作为内标物，可满足测定要求，方法专属性较强。见图1。
2.3.7 线性关系考察 精密吸取对照品贮备液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、2.0、5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，各精密加入内标溶液1.0 mL，用乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取2.0 μL，注入气相色谱仪测定，以冰片与内标水杨酸甲酯峰面积之比为纵坐标，冰片浓度为横坐标建立标准曲线，得回归方程Y=14.06X+0.067 8，r=0.999 9。表明冰片在0.048 4～1.210 0 μg范围内线性关系良好。
2.3.8 精密度试验 取同一紫朱软膏供试品溶液，连续进样测定6次，计算冰片（异龙脑和龙脑）与内标水杨酸甲酯峰面积之比，油脂性紫朱软膏平均值为3.079 4（RSD=0.46%，n=6），水溶性紫朱软膏平均值为2.557 8（RSD=0.35%，n=6）。
2.3.9 稳定性试验 取同一紫朱软膏供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，计算冰片峰面积与内标峰面积之比，油脂性紫朱软膏平均值为3.148 8（RSD=1.59%），水溶性紫朱软膏平均值为2.656 7（RSD=0.83%），表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.3.10 重复性试验 取同一批紫朱软膏，分取6份，每份5 g，分别按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，油脂性紫朱软膏平均值为4.377 0（RSD=1.77%），水溶性紫朱软膏平均值为3.591 2（RSD=3.05%）。
2.3.11 加样回收率试验 分别取2种紫朱软膏各2.5 g（120%、100%、80%），加硅藻土适量研匀，按照“2.3.3”项下方法提取，分别加入80%、100%、120%的冰片标准贮备液，置于10 mL容量瓶中，乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。按“2.3.4”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1、表2。
3 讨论
紫草、冰片均含热不稳定成分，试验过程中应特别注意温度不宜过高；用溶剂萃取时应尽量使其充分分层，以除去基质对定性鉴别和含量测定的干扰。
紫草鉴别时曾考察比较了硅胶、活性炭、中性氧化铝[2]等不同吸附剂对软膏基质的吸附性能，结果以中性氧化铝的吸附性能最好。
对冰片的鉴别曾尝试用硅藻土分散石油醚冰浴超声法[3]处理，结果仍有大量基质残留，最后采用硅藻土分散，挥发油测定法来处理样品，所得斑点清晰，可以很好地鉴别出冰片。对冰片的薄层层析展开剂进行选择，最终确定展开剂组成以环己烷-氯仿-乙酸乙酯（10∶1∶2）[4]为最佳。对冰片的含量测定考察了不同提取时间的提取效率，最终确定最佳提取时间为4 h。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：336.
[2] 蔡清宇，唐慧慧，康琛，等.HPLC测定柴银口服液中连翘苷含量[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（16）：94-95.
[3] 胡奇志，聂黎行，刘燕，等.活血止痛制剂中樟脑的限量检查和冰片的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（18）：117-120.
[4] 袁汀.育红油膏的质量标准研究[J].山西医药杂志，2010，39（11）：1131-1132.
（收稿日期：2013-11-27；编辑：陈静）
关键词：紫朱软膏；紫草；冰片；薄层色谱法；气相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.029
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0095-03
Abstract：Objective To establish the quality standards of Zizhu ointment. Methods The TLC was applied to identify Radix arnebiae and borneol of Zizhu ointment， and the content of borneol was determined by gas chromatography. Results The TLC spots were clear， well-separated and easy to identify. The good linear range of borneol reference substance on calibration curve was 0.0484-1.2100 μg， and the recovery was 90%-110%， the relative standard deviation was less than 5%. Conclusion The method is simple and feasible， can be used as the quality control method of Zizhu ointment.
Key words：Zizhu ointment；Radix arnebiae；borneol；TLC；GC
紫朱软膏为上海中医药大学附属曙光医院院内制剂，由紫草、朱砂、冰片、黄芪、龙血竭、阿胶6味药组成，具有清热解毒、祛腐生肌、补气益血功效，临床主要用于糖尿病足的治疗。本研究采用现代外用制剂方法和技术，对医院制剂进行剂型改进，研制出油脂性和水溶性2种软膏，其中油脂性软膏以羊毛脂、白凡士林、聚乙二醇等为主要基质，水溶性软膏以水、泊洛沙姆、甘油、聚乙二醇类为主要基质。本试验采用薄层色谱法对2种软膏中的紫草和冰片进行定性鉴别，采用气相色谱法对冰片进行含量测定，建立可控制该制剂质量的标准。
1 仪器与试药
BS2202S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），BRANSON B5500S-MT超声清洗仪（必能信超声上海有限公司），Centrifuge 5810R离心机（eppendorf），旋转蒸发仪（BUCHI公司），CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER 4自动点样仪、CAMAG REPROSTAR 3拍照仪（瑞士卡玛公司），Molcell 1805v细胞型超纯水机（上海摩勒生物科技有限公司），安捷伦6890N气相色谱仪（美国安捷伦公司），XS 105型电子天平（METTLER TOLEDO），ZNHW-Ⅱ-500mL智能数显恒温电热套（巩义予华仪器厂）。硅胶G板（上海东方药品科技实业有限公司，批号20120120）。
硅藻土、甲醇、石油醚（60～90 ℃）、环己烷、乙酸乙酯、无水甲酸、氢氧化钾（上海凌峰化学试剂有限公司），中性氧化铝100～200目、甲苯、香兰素、硫酸（国药集团化学试剂有限公司），硅藻土为化学纯，中性氧化铝为柱层析用，其余均为分析纯。紫草对照药材（批号121430-200802）、冰片对照品（批号110743-200905）购自中国药品生物制品检定所，水杨酸甲酯（SIGMA公司，批号101164573），紫朱软膏、阴性样品均为实验室自制。
2 方法与结果
2.1 薄层色谱鉴别
2.1.1 紫草 称取油脂性紫朱软膏20 g，硅藻土30 g，于研钵中研磨。研匀后转移至锥形瓶中，加甲醇100 mL，超声提取20 min，离心后上清液过滤，滤液减压至干。残渣以石油醚（60～90 ℃）与水各30 mL少量多次交互洗涤后转移至分液漏斗中，静置分层，分取石油醚层，以水洗3遍，旋蒸浓缩至2 mL，以中性氧化铝（100～200目）3 g吸附，再用甲醇洗3遍，挥干甲醇后，加入环己烷-甲酸（100∶1）20 mL超声提取15 min，提取液离心过滤，滤液减压蒸干，残渣以石油醚1 mL溶解，即得供试品溶液。另取缺紫草的阴性油脂性紫朱软膏、水溶性紫朱软膏和缺紫草的阴性水溶性紫朱软膏各20 g，同法制备供试品溶液。再取紫草对照药材0.2 g，同法制成紫草对照药材溶液。照《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B[1]试验，吸取紫草对照药材溶液2 μL、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1）为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液至斑点显色。供试品色谱中，在与紫草对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝色的2个斑点，两阴性对照溶液均无干扰。
2.1.2 冰片 称取油脂性紫朱软膏10 g，加硅藻土15 g研磨，研匀后转移至500 mL圆底烧瓶，加水150 mL与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。置电热套中，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分并溢流入烧瓶时为止，再加甲苯2 mL，缓缓加热至沸腾，并保持微沸约3 h，静置1 h，待冷却后将挥发油测定器中的液体移至分液漏斗中，测定器用少量甲苯洗涤，分取甲苯层，另加乙酸乙酯适量，稀释至10 mL，离心后吸取上清液1 mL作为供试品溶液。另取缺冰片的阴性油脂性紫朱软膏、水溶性紫朱软膏和缺冰片的阴性水溶性紫朱软膏各10 g，同法制备供试品溶液。再取冰片对照药材1.00 mg加乙酸乙酯1 mL溶解，制成对照药材溶液。吸取对照药材溶液1 μL、供试品溶液及阴性对照溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-乙酸乙酯（10∶1∶2）为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰，置日光下观察。供试品色谱中，在与冰片对照药材色谱相应位置上，显2个相同紫红色斑点，两阴性对照溶液均无相应斑点。 2.3 冰片含量测定
2.3.1 对照品贮备液的制备 精密称取冰片对照品60.30 mg，于50 mL容量瓶，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含1.206 0 mg的溶液。
2.3.2 内标溶液的制备 精密称取水杨酸甲酯100.50 mg，于100 mL容量瓶，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含1.005 0 mg的溶液。
2.3.3 供试品溶液的制备 称取油脂性紫朱软膏5 g，加硅藻土7.5 g研磨，研匀后转移至500 mL圆底烧瓶，加水150 mL与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。置电热套中，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分并溢流入烧瓶时为止，再加甲苯2 mL，缓缓加热至沸腾，并保持微沸约3 h，静置1 h，待冷却后将挥发油测定器中的液体移至分液漏斗中，测定器用少量甲苯洗涤，分取甲苯层，另加乙酸乙酯适量，稀释至10 mL，离心后吸取上清溶液1 mL作为供试品溶液。另取缺冰片的阴性油脂性紫朱软膏、水溶性紫朱软膏和缺冰片的阴性水溶性紫朱软膏各5 g，同法制备供试品溶液。
2.3.4 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：HP INNOWAX毛细管色谱柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；氢火焰离子化检测器，载气N2压力为115.836 kPa、流速为3 mL/min，H2流速为45 mL/min，空气流速为400 mL/min，柱温120 ℃，进样口温度220 ℃，检测器温度250 ℃，分流比10∶1，N2尾吹流速为45 mL/min。
2.3.5 校正因子的计算 精密量取0.8、1.0、1.2 mL的冰片对照品贮备液，加入1.0 mL水杨酸甲酯内标溶液，于10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀。按上述色谱条件进样，计算校正因子。
2.3.6 专属性考察 分别精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液2.0 μL，注入气相色谱仪进行测定，阴性对照溶液均无干扰。水杨酸甲酯色谱峰与冰片色谱峰分离度良好，其作为内标物，可满足测定要求，方法专属性较强。见图1。
2.3.7 线性关系考察 精密吸取对照品贮备液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、2.0、5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，各精密加入内标溶液1.0 mL，用乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取2.0 μL，注入气相色谱仪测定，以冰片与内标水杨酸甲酯峰面积之比为纵坐标，冰片浓度为横坐标建立标准曲线，得回归方程Y=14.06X+0.067 8，r=0.999 9。表明冰片在0.048 4～1.210 0 μg范围内线性关系良好。
2.3.8 精密度试验 取同一紫朱软膏供试品溶液，连续进样测定6次，计算冰片（异龙脑和龙脑）与内标水杨酸甲酯峰面积之比，油脂性紫朱软膏平均值为3.079 4（RSD=0.46%，n=6），水溶性紫朱软膏平均值为2.557 8（RSD=0.35%，n=6）。
2.3.9 稳定性试验 取同一紫朱软膏供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，计算冰片峰面积与内标峰面积之比，油脂性紫朱软膏平均值为3.148 8（RSD=1.59%），水溶性紫朱软膏平均值为2.656 7（RSD=0.83%），表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.3.10 重复性试验 取同一批紫朱软膏，分取6份，每份5 g，分别按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，油脂性紫朱软膏平均值为4.377 0（RSD=1.77%），水溶性紫朱软膏平均值为3.591 2（RSD=3.05%）。
2.3.11 加样回收率试验 分别取2种紫朱软膏各2.5 g（120%、100%、80%），加硅藻土适量研匀，按照“2.3.3”项下方法提取，分别加入80%、100%、120%的冰片标准贮备液，置于10 mL容量瓶中，乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。按“2.3.4”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1、表2。
3 讨论
紫草、冰片均含热不稳定成分，试验过程中应特别注意温度不宜过高；用溶剂萃取时应尽量使其充分分层，以除去基质对定性鉴别和含量测定的干扰。
紫草鉴别时曾考察比较了硅胶、活性炭、中性氧化铝[2]等不同吸附剂对软膏基质的吸附性能，结果以中性氧化铝的吸附性能最好。
对冰片的鉴别曾尝试用硅藻土分散石油醚冰浴超声法[3]处理，结果仍有大量基质残留，最后采用硅藻土分散，挥发油测定法来处理样品，所得斑点清晰，可以很好地鉴别出冰片。对冰片的薄层层析展开剂进行选择，最终确定展开剂组成以环己烷-氯仿-乙酸乙酯（10∶1∶2）[4]为最佳。对冰片的含量测定考察了不同提取时间的提取效率，最终确定最佳提取时间为4 h。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：336.
[2] 蔡清宇，唐慧慧，康琛，等.HPLC测定柴银口服液中连翘苷含量[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（16）：94-95.
[3] 胡奇志，聂黎行，刘燕，等.活血止痛制剂中樟脑的限量检查和冰片的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（18）：117-120.
[4] 袁汀.育红油膏的质量标准研究[J].山西医药杂志，2010，39（11）：1131-1132.
（收稿日期：2013-11-27；编辑：陈静）