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摘要：目的 观察糖脂平对喂养型胰岛素抵抗大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平及脂肪组织mRNA表达的影响，探讨其抗动脉粥样硬化（AS）的作用机制。方法 将28只清洁级SD大鼠随机分为对照组、模型组、中药组和西药组，采用高脂高盐饲料喂养，造模成功后分别给予生理盐水、糖脂平和罗格列酮灌胃。给药8周后，用放免法测定各组大鼠血清TNF-α水平，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定附睾旁脂肪组织TNF-α mRNA表达水平。结果 模型组大鼠血清TNF-α水平为（1.78±0.13）ng/mL，较对照组大鼠明显升高，糖脂平或罗格列酮灌胃可分别使模型大鼠血清TNF-α水平降至（1.46±0.13）ng/mL和（1.32±0.16）ng/mL，差异有统计学意义（P<0.01）。模型组大鼠脂肪组织TNF-α mRNA表达量较对照组显著升高（P<0.01），与模型组相比，糖脂平或罗格列酮灌胃可分别使TNF-α mRNA下降30.2%和31.6%，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 糖脂平改善胰岛素抵抗和抗AS作用可能与其降低血清TNF-α水平，抑制TNF-α mRNA过度表达有关。
关键词：胰岛素抵抗；糖脂平；肿瘤坏死因子-α；大鼠
胰岛素抵抗（IR）及其相关疾病是导致动脉粥样硬化（AS）的重要危险因素。炎症学说的提出更进一步增强了二者之间的密切联系，慢性非特异性炎症可能是IR引起AS的重要发病机制之一，甚至可能是IR和AS发生发展的“共同土壤”[1-3]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是AS发生发展过程中一个重要的炎症因子，而IR人群血清TNF-α水平升高且脂肪组织TNF-α mRNA表达增强，所以TNF-α在IR人群AS的发生发展过程中扮演了重要的角色[4-5]。本研究通过观察糖脂平对喂养型IR大鼠血清TNF-α水平及其脂肪组织TNF-α mRNA表达的影响，探讨其抗AS的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，28只，北京大学医学部实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK（京） 2006-0025，生产许可证号：SCXK（京）2006-2008。
1.2 动物饲料
基础饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供；高脂高盐饲料由基础饲料加猪油21%、胆固醇1.5%、食盐2%制成，热量比为碳水化合物20%、脂肪59%、蛋白质21%，北京科澳协力饲料有限公司提供。
1.3 药物与试剂
糖脂平由丹参、泽泻、黄连、大黄等组成，每1 mL含原药材2 g，北京中医药大学东方医院制剂中心提供；马来酸罗格列酮由葛兰素史克（天津）有限公司生产，规格4 mg/片。Trizol试剂购自Invitrogen公司；Oligo-dT、M-MLV 反转录酶、RNase抑制剂、dNTP及Taq DNA聚合酶购自Promega公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）、溴化乙锭（EB）购自Sigma公司；琼脂糖（Agrose）购自BIOWEST公司；氯仿、异丙醇及无水乙醇等均为国产分析纯化学试剂；TNF-α放免试剂盒购自中国人民解放军总医院东亚放免所。
1.4 仪器
PCR仪：英国TECHNE公司，TC-412；紫外/可见分光光度计：德国EPPENDORF公司，Biophotometer；低温台式离心机：德国EPPENDORF公司，5417R；稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂，DYY-6B；Gene Genius凝胶成像系统：英国SYNGENE公司；图像分析系统：德国LEICA公司，550IW；智能放免γ测量仪：上海核所日环光电仪器有限公司，N-695B型；低温离心机：上海安厅科学仪器厂，DDL-5型。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[6]方法采用高脂高盐饲料喂养造模。28只雄性SD大鼠在基础饲料适应性饲养1周后随机分为对照组、模型组、中药组、西药组各7只，对照组给予基础饲料喂养，其他3组给予高脂高盐饲料喂养，明暗周期12 h/12 h，自由摄食、饮水。喂养6周后，断尾采血测空腹血糖（FPG）和空腹胰岛素（FINS），计算胰岛素抵抗指数[IAI=-ln（FPG×FINS）]，以正常组IAI作为标准，小于该值为造模成功。
2.2 分组
第8周开始，中药组给予糖脂平[10 mL/（kg·d），原药材20 g/（kg·d）]灌胃；西药组给予马来酸罗格列酮2 mg/（kg·d）灌胃；模型组和对照组给予灌服等量的蒸馏水。对照组仍给予基础饲料喂养，模型组、中药组、西药组继续给予高脂高盐饲料喂养，连续给药观察8周。喂养条件不变，明暗周期12 h/12 h，自由摄食、饮水。
2.3 检测指标与方法
第15周末，末次给药后禁食12 h。以0.45%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射进行麻醉。经腹主动脉取血2.5 mL到离心管中，不抗凝，室温静置1 h，2 500 r/min离心15 min，取血清0.5 mL，用于TNF-α水平测定。处死动物后迅速取附睾旁脂肪组织约1 g冻存备用。
2.3.1 血清肿瘤坏死因子-α测定 采用放免法测定，按照试剂盒说明书进行操作。
5 讨论
Ross[1]提出的炎症学说认为，慢性、亚临床性、非特异性免疫介导的炎症能促进AS的发生发展，并参与心血管事件的发生。随着基础研究的深入和临床证据的不断丰富，这一学说已得到越来越广泛的认可和接受。通过抑制致AS的炎症因子的产生、保护血管内皮细胞、抑制血管平滑肌细胞的增殖、抑制泡沫细胞的形成，进而抑制AS的发生发展，是目前防治AS相关疾病的一个重要思路。
脂源性和肌源性的TNF-α与肥胖和IR的关系密切，同时TNF-α的升高也参与了AS的发生和发展。TNF-α作为促炎症性因子，促进了活化和炎症反应，在AS病变局部起到多方面的作用，它可以影响巨噬细胞载脂蛋白E的分泌，增加清道夫受体的活性，参与炎症过程并导致血液高凝状态，促进AS的形成。 本实验结果表明，采用高脂高盐饲料喂养的IR大鼠血清TNF-α水平明显升高，与对照组比较差异有统计学意义，说明模型组大鼠存在慢性炎症。中药组血清TNF-α水平与模型组比较明显减低，差异有统计学意义，但不能恢复到正常水平，与西药组比较差异无统计学意义。提示中药糖脂平有部分抑制轻度炎症的作用，而这种作用有利于保护血管内皮和延缓AS的发生和进展。同时，糖脂平可以部分抑制IR大鼠脂肪细胞内TNF-α mRNA的高表达，而脂肪细胞内TNF-α mRNA的高表达被认为是IR状态下TNF-α升高的重要原因，可以推论这可能是糖脂平降低血清TNF-α水平的作用机制之一。
综上所述，糖脂平通过抑制脂肪细胞内TNF-α mRNA的高表达，降低了IR大鼠血清TNF-α水平，有利于保护血管内皮和延缓AS的发生和发展。
参考文献：
[1] Ross R. Cell biology of atherosclerosis[J]. Ann Rev Physiol，1995， 57：791-795.
[2] Feata A， D’Agostino R Jr， Howard G， et al. Chronic subclinicial inflammation as part of the insulin resistance syndrome：the Insulin Resistance Atherosclerosis Study（IRAS）[J]. Circulation， 2000，102：42-47.
[3] Yudhin JS， Stehouwer CDA， Emeis JJ， et al. C-reactive protein in health subjects：association with obesity， insulin resistance， and endothelial dysfunction：a potential role of cytokines origination from adipose tissue？[J]. Atheroscler Thromb Vase Biol，1999，19：972-978.
[4] Hotamisligil GS， Shargill NS， Spiegelman BM. Adipose expression of tumor necrosis factor-α：director role in obesity-linked insulin resistance[J]. Science，1993，259：87-91.
[5] Hotamisligil GS， Arner P， Caro JF， et al. Increased adipose tissue expression of tumor necrosis factor-α：in human obesity and insulin resistance[J]. J Clin Invest，1995，95（5）：2409-2415.
[6] 曹廷兵，闫振成，沈成义，等.代谢综合征大鼠模型的建立及其相关基因表达变化的研究[J].解放军医学杂志，2005，30（8）：702-705.
（收稿日期：2012-01-06，编辑：华强）
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）07-0034-03
关键词：胰岛素抵抗；糖脂平；肿瘤坏死因子-α；大鼠
胰岛素抵抗（IR）及其相关疾病是导致动脉粥样硬化（AS）的重要危险因素。炎症学说的提出更进一步增强了二者之间的密切联系，慢性非特异性炎症可能是IR引起AS的重要发病机制之一，甚至可能是IR和AS发生发展的“共同土壤”[1-3]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是AS发生发展过程中一个重要的炎症因子，而IR人群血清TNF-α水平升高且脂肪组织TNF-α mRNA表达增强，所以TNF-α在IR人群AS的发生发展过程中扮演了重要的角色[4-5]。本研究通过观察糖脂平对喂养型IR大鼠血清TNF-α水平及其脂肪组织TNF-α mRNA表达的影响，探讨其抗AS的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，28只，北京大学医学部实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK（京） 2006-0025，生产许可证号：SCXK（京）2006-2008。
1.2 动物饲料
基础饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供；高脂高盐饲料由基础饲料加猪油21%、胆固醇1.5%、食盐2%制成，热量比为碳水化合物20%、脂肪59%、蛋白质21%，北京科澳协力饲料有限公司提供。
1.3 药物与试剂
糖脂平由丹参、泽泻、黄连、大黄等组成，每1 mL含原药材2 g，北京中医药大学东方医院制剂中心提供；马来酸罗格列酮由葛兰素史克（天津）有限公司生产，规格4 mg/片。Trizol试剂购自Invitrogen公司；Oligo-dT、M-MLV 反转录酶、RNase抑制剂、dNTP及Taq DNA聚合酶购自Promega公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）、溴化乙锭（EB）购自Sigma公司；琼脂糖（Agrose）购自BIOWEST公司；氯仿、异丙醇及无水乙醇等均为国产分析纯化学试剂；TNF-α放免试剂盒购自中国人民解放军总医院东亚放免所。
1.4 仪器
PCR仪：英国TECHNE公司，TC-412；紫外/可见分光光度计：德国EPPENDORF公司，Biophotometer；低温台式离心机：德国EPPENDORF公司，5417R；稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂，DYY-6B；Gene Genius凝胶成像系统：英国SYNGENE公司；图像分析系统：德国LEICA公司，550IW；智能放免γ测量仪：上海核所日环光电仪器有限公司，N-695B型；低温离心机：上海安厅科学仪器厂，DDL-5型。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[6]方法采用高脂高盐饲料喂养造模。28只雄性SD大鼠在基础饲料适应性饲养1周后随机分为对照组、模型组、中药组、西药组各7只，对照组给予基础饲料喂养，其他3组给予高脂高盐饲料喂养，明暗周期12 h/12 h，自由摄食、饮水。喂养6周后，断尾采血测空腹血糖（FPG）和空腹胰岛素（FINS），计算胰岛素抵抗指数[IAI=-ln（FPG×FINS）]，以正常组IAI作为标准，小于该值为造模成功。
2.2 分组
第8周开始，中药组给予糖脂平[10 mL/（kg·d），原药材20 g/（kg·d）]灌胃；西药组给予马来酸罗格列酮2 mg/（kg·d）灌胃；模型组和对照组给予灌服等量的蒸馏水。对照组仍给予基础饲料喂养，模型组、中药组、西药组继续给予高脂高盐饲料喂养，连续给药观察8周。喂养条件不变，明暗周期12 h/12 h，自由摄食、饮水。
2.3 检测指标与方法
第15周末，末次给药后禁食12 h。以0.45%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射进行麻醉。经腹主动脉取血2.5 mL到离心管中，不抗凝，室温静置1 h，2 500 r/min离心15 min，取血清0.5 mL，用于TNF-α水平测定。处死动物后迅速取附睾旁脂肪组织约1 g冻存备用。
2.3.1 血清肿瘤坏死因子-α测定 采用放免法测定，按照试剂盒说明书进行操作。
5 讨论
Ross[1]提出的炎症学说认为，慢性、亚临床性、非特异性免疫介导的炎症能促进AS的发生发展，并参与心血管事件的发生。随着基础研究的深入和临床证据的不断丰富，这一学说已得到越来越广泛的认可和接受。通过抑制致AS的炎症因子的产生、保护血管内皮细胞、抑制血管平滑肌细胞的增殖、抑制泡沫细胞的形成，进而抑制AS的发生发展，是目前防治AS相关疾病的一个重要思路。
脂源性和肌源性的TNF-α与肥胖和IR的关系密切，同时TNF-α的升高也参与了AS的发生和发展。TNF-α作为促炎症性因子，促进了活化和炎症反应，在AS病变局部起到多方面的作用，它可以影响巨噬细胞载脂蛋白E的分泌，增加清道夫受体的活性，参与炎症过程并导致血液高凝状态，促进AS的形成。 本实验结果表明，采用高脂高盐饲料喂养的IR大鼠血清TNF-α水平明显升高，与对照组比较差异有统计学意义，说明模型组大鼠存在慢性炎症。中药组血清TNF-α水平与模型组比较明显减低，差异有统计学意义，但不能恢复到正常水平，与西药组比较差异无统计学意义。提示中药糖脂平有部分抑制轻度炎症的作用，而这种作用有利于保护血管内皮和延缓AS的发生和进展。同时，糖脂平可以部分抑制IR大鼠脂肪细胞内TNF-α mRNA的高表达，而脂肪细胞内TNF-α mRNA的高表达被认为是IR状态下TNF-α升高的重要原因，可以推论这可能是糖脂平降低血清TNF-α水平的作用机制之一。
综上所述，糖脂平通过抑制脂肪细胞内TNF-α mRNA的高表达，降低了IR大鼠血清TNF-α水平，有利于保护血管内皮和延缓AS的发生和发展。
参考文献：
[1] Ross R. Cell biology of atherosclerosis[J]. Ann Rev Physiol，1995， 57：791-795.
[2] Feata A， D’Agostino R Jr， Howard G， et al. Chronic subclinicial inflammation as part of the insulin resistance syndrome：the Insulin Resistance Atherosclerosis Study（IRAS）[J]. Circulation， 2000，102：42-47.
[3] Yudhin JS， Stehouwer CDA， Emeis JJ， et al. C-reactive protein in health subjects：association with obesity， insulin resistance， and endothelial dysfunction：a potential role of cytokines origination from adipose tissue？[J]. Atheroscler Thromb Vase Biol，1999，19：972-978.
[4] Hotamisligil GS， Shargill NS， Spiegelman BM. Adipose expression of tumor necrosis factor-α：director role in obesity-linked insulin resistance[J]. Science，1993，259：87-91.
[5] Hotamisligil GS， Arner P， Caro JF， et al. Increased adipose tissue expression of tumor necrosis factor-α：in human obesity and insulin resistance[J]. J Clin Invest，1995，95（5）：2409-2415.
[6] 曹廷兵，闫振成，沈成义，等.代谢综合征大鼠模型的建立及其相关基因表达变化的研究[J].解放军医学杂志，2005，30（8）：702-705.
（收稿日期：2012-01-06，编辑：华强）
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）07-0034-03