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昆明市中医医院，云南 昆明 650011
摘要：目的 观察七龙天对缺氧大鼠动脉血气及肺组织中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的影响，为探寻云南民族医药防治慢性缺氧性肺病的有效手段提供实验依据。方法 将SD大鼠40只随机分为5组，即正常对照组、模型组及七龙天低、中、高剂量组，每组8只，除正常对照组以外均以常压低氧法制备大鼠缺氧模型。给药组分别于造模第1日始灌胃相应剂量的七龙天，连续用药3周。腹主动脉采血行血气分析，采用蛋白免疫印迹法检测肺组织中VEGF的蛋白表达。结果 与正常对照组比较，模型对照组大鼠血气分析比较差异无统计学意义（P>0.05），VEGF蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与模型对照组比较，七龙天中、高剂量组大鼠VEGF的蛋白表达水平明显降低，以高剂量组最为显著（P<0.05）。结论 七龙天可显著抑制缺氧诱导血管新生形成。
关键词：七龙天；缺氧；动脉血气；血管内皮生长因子；缺氧诱导血管新生；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0033-02
慢性缺氧性肺系疾病是临床常见病，因高原缺氧、气候变化快、烟民众多等地域特点，云南地区患病率高于全国平均水平。此类疾病反复发作，危害大，疾病经济负担沉重，已成为区域性重大疾病。目前，在发病机制方面，缺氧诱导血管新生是新的研究方向[1]。本课题从云南民族医药中寻求灵感，观察复方七龙天对缺氧大鼠动脉血气及肺组织中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的影响，为阐明七龙天防治缺氧诱导血管新生的机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级SD大鼠40只，体质量180～200 g，鼠龄6周，北京维通利华公司提供，合格证号：SCXK（京）2006-0009。
1.2 药物
七龙天由云南文山三七、迪庆高山红景天等组成，昆明市中医院制剂中心（GPP认证，滇：2010009HZ）制成干粉剂，4 ℃保存。
1.3 主要试剂与仪器
VEGF抗体（SC-7269，Santa Cruz）；β-actin抗体（SC-47778， Santa Cruz）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（ZDR-5307，中杉金桥）；通用型SP试剂盒（SP9000，中杉金桥）；DAB显色试剂盒（中杉金桥）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂cocktail（普利莱）；肝素钠、戊巴比妥钠（Sigma），钠石灰、无水氯化钙（北京化学试剂厂）。自制小动物有机玻璃低氧舱2个（65 cm×50 cm×28 cm，二个通气口一个排气口，北京有机玻璃厂），数字测氧仪CY-12C型（建德市梅城电化分析仪器厂），转子气体流量计（上海流量计厂），氮气、空气（北京千禧气体），动物血气分析仪（ABL，丹麦雷度），血气针（3302型，美国威世德）。
1.4 分组与给药
将大鼠适应性饲养1周后按随机数字表法分为正常组、模型组及七龙天低、中、高剂量组，每组8只。参考人和动物体表面积折算的等效剂量比率表[2]，每只动物每千克体质量给药量按临床人的等效量为中剂量，0.5倍等效量为小剂量，2倍等效量为大剂量。通过测算，低、中、高组给药量分别为0.35、0.7、1.4 g/kg。七龙天药粉用蒸馏水配成低、中、高3个剂量（35、70、140 g/L）。正常对照组、模型对照组给予等量蒸馏水。从造模第1日开始，分别于每日9：00-9：30灌胃（10 mL/kg），连续3周，至检查前12 h停药。
1.5 造模
采用常压低氧法[3]，预先开启风扇和测氧仪。给药后将造模各组大鼠置于低氧舱内造模。大鼠全部置于低氧舱后，放入盛有钠石灰和无水氯化钙的小盒（吸收舱内的水蒸气和二氧化碳），统一关闭舱门，通氮气至氧浓度降低到11%，调小氮气流量，打开空气阀，使氧浓度保持在10%±0.5%。造模8 h/d，6 d/周，共3周。8 h内，包括常氧对照组在内的所有组禁水禁粮。造模结束后取出动物放回鼠笼，补水补粮。
1.6 观测指标
1.6.1 一般情况 大鼠形态、行为观察。
1.6.2 大鼠动脉血气分析 动物于造模结束后的第2日，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（6.6 mL/kg），从腹主动脉用血气针采取动脉血送检。
1.6.3 血管内皮生长因子蛋白表达测定 取右肺中叶放入液氮中冻存，检测时称取小块冻存的肺组织，每100 mg样本加1 mL RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂cocktail），用玻璃匀浆器冰浴匀浆，转移到1.5 mL EP管中，加等体积2×Loading Buffer，100 ℃金属浴5 min，离心取上清。12% SDS-PAGE电泳，转至45 ?m PVDF膜（295 mA，1.5 hr），2%脱脂奶粉封闭1.5 h， VEGF一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜，PBST洗膜，羊抗鼠二抗（1∶3 000）室温孵育1.5 h，PBST洗膜，加发光液显影。
1.7 统计学方法
使用SPSS17.0软件进行统计分析，数据用—x±s表示，2组间比较采用t检验，多重比较采用SNK法，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠形态、行为变化
大鼠处于低氧环境下，大部分趴下睡觉，少有活动。呼吸频率加快，皮毛竖立不顺，对外界刺激不敏感。恢复到常氧后表现出躁动，打闹剧烈且频繁。用手抓住灌胃时，感到皮肉紧致。最后1周在低氧箱中大鼠仰卧着睡觉。正常对照组平时多有活动，如理毛、嗅探，少有打闹且不剧烈，毛发平顺，皮肉松弛。
2.2 七龙天对缺氧大鼠动脉血气的影响（见表1）
2.3 七龙天对缺氧大鼠肺组织血管内皮生长因子蛋白表达的影响（见表2、图1）
3 讨论
通过观察发现，大鼠在缺氧环境下明显感觉不适，并做出适应性反应，如减少活动以降低耗氧量，呼吸频率加快以加大对氧的摄取。从动脉血气分析得知各组无明显差异，分析原因有二：一是间断低氧，可能在常氧状态下实验动物氧合迅速恢复；二是低等动物对缺氧的耐受力和代偿能力可能极强。
七龙天是由云南高原民族药物（文山砚山盘龙7年生三七、迪庆香格里拉高山红景天等）为主组成的临床验方，具有益气扶正、化瘀通络、消痰平喘之功，针对慢性缺氧性肺病“虚、瘀、痰”三大病理要素，临床应用疗效卓著[4]。现代药理研究表明，红景天能够提高机体对低含氧环境的适应性，增强动物对缺氧和疲劳的耐力[5]，三七[6]、红景天[7]均具有显著的抗炎作用，三七能明显抑制角叉菜胶诱导的炎细胞增多和蛋白渗出外，对炎症介质引起的血管收缩、炎性渗出和炎性肉芽组织增生均有抑制作用，三七皂苷能抑制细胞外Ca2+内流，抑制肺血管收缩。地龙具有抗凝、溶栓的双重作用，蚓激酶可使体外血栓形成的时间延长[8]。红景天具有抑制
摘要：目的 观察七龙天对缺氧大鼠动脉血气及肺组织中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的影响，为探寻云南民族医药防治慢性缺氧性肺病的有效手段提供实验依据。方法 将SD大鼠40只随机分为5组，即正常对照组、模型组及七龙天低、中、高剂量组，每组8只，除正常对照组以外均以常压低氧法制备大鼠缺氧模型。给药组分别于造模第1日始灌胃相应剂量的七龙天，连续用药3周。腹主动脉采血行血气分析，采用蛋白免疫印迹法检测肺组织中VEGF的蛋白表达。结果 与正常对照组比较，模型对照组大鼠血气分析比较差异无统计学意义（P>0.05），VEGF蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与模型对照组比较，七龙天中、高剂量组大鼠VEGF的蛋白表达水平明显降低，以高剂量组最为显著（P<0.05）。结论 七龙天可显著抑制缺氧诱导血管新生形成。
关键词：七龙天；缺氧；动脉血气；血管内皮生长因子；缺氧诱导血管新生；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0033-02
慢性缺氧性肺系疾病是临床常见病，因高原缺氧、气候变化快、烟民众多等地域特点，云南地区患病率高于全国平均水平。此类疾病反复发作，危害大，疾病经济负担沉重，已成为区域性重大疾病。目前，在发病机制方面，缺氧诱导血管新生是新的研究方向[1]。本课题从云南民族医药中寻求灵感，观察复方七龙天对缺氧大鼠动脉血气及肺组织中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的影响，为阐明七龙天防治缺氧诱导血管新生的机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级SD大鼠40只，体质量180～200 g，鼠龄6周，北京维通利华公司提供，合格证号：SCXK（京）2006-0009。
1.2 药物
七龙天由云南文山三七、迪庆高山红景天等组成，昆明市中医院制剂中心（GPP认证，滇：2010009HZ）制成干粉剂，4 ℃保存。
1.3 主要试剂与仪器
VEGF抗体（SC-7269，Santa Cruz）；β-actin抗体（SC-47778， Santa Cruz）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（ZDR-5307，中杉金桥）；通用型SP试剂盒（SP9000，中杉金桥）；DAB显色试剂盒（中杉金桥）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂cocktail（普利莱）；肝素钠、戊巴比妥钠（Sigma），钠石灰、无水氯化钙（北京化学试剂厂）。自制小动物有机玻璃低氧舱2个（65 cm×50 cm×28 cm，二个通气口一个排气口，北京有机玻璃厂），数字测氧仪CY-12C型（建德市梅城电化分析仪器厂），转子气体流量计（上海流量计厂），氮气、空气（北京千禧气体），动物血气分析仪（ABL，丹麦雷度），血气针（3302型，美国威世德）。
1.4 分组与给药
将大鼠适应性饲养1周后按随机数字表法分为正常组、模型组及七龙天低、中、高剂量组，每组8只。参考人和动物体表面积折算的等效剂量比率表[2]，每只动物每千克体质量给药量按临床人的等效量为中剂量，0.5倍等效量为小剂量，2倍等效量为大剂量。通过测算，低、中、高组给药量分别为0.35、0.7、1.4 g/kg。七龙天药粉用蒸馏水配成低、中、高3个剂量（35、70、140 g/L）。正常对照组、模型对照组给予等量蒸馏水。从造模第1日开始，分别于每日9：00-9：30灌胃（10 mL/kg），连续3周，至检查前12 h停药。
1.5 造模
采用常压低氧法[3]，预先开启风扇和测氧仪。给药后将造模各组大鼠置于低氧舱内造模。大鼠全部置于低氧舱后，放入盛有钠石灰和无水氯化钙的小盒（吸收舱内的水蒸气和二氧化碳），统一关闭舱门，通氮气至氧浓度降低到11%，调小氮气流量，打开空气阀，使氧浓度保持在10%±0.5%。造模8 h/d，6 d/周，共3周。8 h内，包括常氧对照组在内的所有组禁水禁粮。造模结束后取出动物放回鼠笼，补水补粮。
1.6 观测指标
1.6.1 一般情况 大鼠形态、行为观察。
1.6.2 大鼠动脉血气分析 动物于造模结束后的第2日，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（6.6 mL/kg），从腹主动脉用血气针采取动脉血送检。
1.6.3 血管内皮生长因子蛋白表达测定 取右肺中叶放入液氮中冻存，检测时称取小块冻存的肺组织，每100 mg样本加1 mL RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂cocktail），用玻璃匀浆器冰浴匀浆，转移到1.5 mL EP管中，加等体积2×Loading Buffer，100 ℃金属浴5 min，离心取上清。12% SDS-PAGE电泳，转至45 ?m PVDF膜（295 mA，1.5 hr），2%脱脂奶粉封闭1.5 h， VEGF一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜，PBST洗膜，羊抗鼠二抗（1∶3 000）室温孵育1.5 h，PBST洗膜，加发光液显影。
1.7 统计学方法
使用SPSS17.0软件进行统计分析，数据用—x±s表示，2组间比较采用t检验，多重比较采用SNK法，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠形态、行为变化
大鼠处于低氧环境下，大部分趴下睡觉，少有活动。呼吸频率加快，皮毛竖立不顺，对外界刺激不敏感。恢复到常氧后表现出躁动，打闹剧烈且频繁。用手抓住灌胃时，感到皮肉紧致。最后1周在低氧箱中大鼠仰卧着睡觉。正常对照组平时多有活动，如理毛、嗅探，少有打闹且不剧烈，毛发平顺，皮肉松弛。
2.2 七龙天对缺氧大鼠动脉血气的影响（见表1）
2.3 七龙天对缺氧大鼠肺组织血管内皮生长因子蛋白表达的影响（见表2、图1）
3 讨论
通过观察发现，大鼠在缺氧环境下明显感觉不适，并做出适应性反应，如减少活动以降低耗氧量，呼吸频率加快以加大对氧的摄取。从动脉血气分析得知各组无明显差异，分析原因有二：一是间断低氧，可能在常氧状态下实验动物氧合迅速恢复；二是低等动物对缺氧的耐受力和代偿能力可能极强。
七龙天是由云南高原民族药物（文山砚山盘龙7年生三七、迪庆香格里拉高山红景天等）为主组成的临床验方，具有益气扶正、化瘀通络、消痰平喘之功，针对慢性缺氧性肺病“虚、瘀、痰”三大病理要素，临床应用疗效卓著[4]。现代药理研究表明，红景天能够提高机体对低含氧环境的适应性，增强动物对缺氧和疲劳的耐力[5]，三七[6]、红景天[7]均具有显著的抗炎作用，三七能明显抑制角叉菜胶诱导的炎细胞增多和蛋白渗出外，对炎症介质引起的血管收缩、炎性渗出和炎性肉芽组织增生均有抑制作用，三七皂苷能抑制细胞外Ca2+内流，抑制肺血管收缩。地龙具有抗凝、溶栓的双重作用，蚓激酶可使体外血栓形成的时间延长[8]。红景天具有抑制