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摘要：目的 观察补阳还五汤对大鼠心肌梗死后左室非梗死区心肌微血管新生的影响。方法 雄性Wistar大鼠，结扎左冠状动脉主干造成心肌梗死模型，将造模成功的大鼠随机分为模型对照组及补阳还五汤低、中、高剂量组，加上假手术组，共5组，每组12只。补阳还五汤低、中、高剂量组分别按9.25、18.5、37 g/（kg·d）给予补阳还五汤水煎剂灌胃，假手术组、模型组给予0.2 mL/10 g生理盐水灌胃。连续给药12周后处死大鼠。免疫组化法检测心肌Ⅷ因子的表达，Westren blot及免疫组化法检测血管内皮细胞生长因子-C（VEGF-C）的表达。结果 假手术组和不同剂量补阳还五汤组血管密度和VEGF-C的表达明显高于模型组（P<0.001）；补阳还五汤中剂量组VEGF-C的表达与假手术组相当（P>0.05），补阳还五汤高剂量组VEGF-C表达高于假手术组（P<0.01）。结论 补阳还五汤可以促进心肌梗死后大鼠左室非梗死区血管新生，并且呈剂量依赖性，补阳还五汤促血管新生作用可能与升高VEGF-C表达有关。
关键词：补阳还五汤；心肌梗死；血管新生；血管内皮细胞生长因子-C；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.010
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0024-03
Key words：Buyanghuanwu decoction；myocardial infarction；blood vessel neogenesis；VEGF-C；rats
目前，虽然介入治疗结合急性心肌梗死后多重危险因素综合控制对于多数患者可增加冠状动脉灌注，提高心肌梗死急性期的治疗效果，改善患者的远期预后，但对冠状动脉纤细和病
变弥散的患者而言，这些治疗手段则难以奏效，无法恢复有效血运。心肌梗死仍是心血管病事件死亡的主要原因之一，心肌梗死后的血运重建仍是抗心肌缺血的主要问题。本研究采用结扎冠脉大鼠模型，探讨补阳还五汤对促进心肌微血管生成作用及其机制，以期为补阳还五汤的临床运用提供实验证据。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性Wistar大鼠75只，体质量150～200 g，南方医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（粤）2006- 0015。
1.2 药物
补阳还五汤按王清任《医林改错》原方组成剂量稍作调整：黄芪30 g，当归尾10 g，赤芍10 g，地龙10 g，川芎10 g，红花10 g，桃仁10 g。药材由广州市药材公司提供。将上述原药材去除杂质，按组方剂量配制混合，蒸馏水浸泡30 min后，用TC-15套式恒温器250 V电压加热煎煮。沸腾后将电压调低至200 V煎煮1 h，过滤得第1次煎液；药渣再加水5 000 mL，煎煮方法同前，过滤得第2次煎液。取两次滤液合并，80 ℃水浴蒸发浓缩至原药材1 g/mL 4 ℃冰箱保存，临用前充分摇匀并加热至室温。
1.3 仪器与试剂
江湾Ⅰ型人工呼吸机，第二军医大学仪器厂；尼康Eclipse Ti-S荧光倒置显微镜，日本尼康公司；Kodak 2 000 MM图像工作站，美国柯达公司。异氟醚购自山东力诺科峰制药有限公司，免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自鼎国生物技术有限公司，抗大鼠血管内皮细胞生长因子-C（VEGF-C）多克隆抗体、羊抗兔IgG/HRP抗体、羊抗小鼠IgG/HRP抗体购自武汉博士德生物技术有限公司，兔抗大鼠Ⅷ因子多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体购自艾比玛特生物医药有限公司，ECL化学发光试剂购自Millipore公司。
2 实验方法
2.1 动物模型制备
按文献[1]方法结扎左冠状动脉主干造成心肌梗死模型。在左冠状动脉起源点下1～2 mm处，结扎左冠状动脉主干，标准肢体导联Ⅱ导ST段抬高，肉眼观察结扎区变白，迅速将心脏放回胸腔，随即缝合肌肉和皮肤，将胸腔内的空气及血液抽尽。术后每隔10 min复查1次心电图，如连续3次ST段抬高即为急性心肌梗死造模成功。假手术组除不结扎冠状动脉外，其余操作与模型组动物相同。术后肌注青霉素4万U，1次/d，共3 d。
2.2 分组与给药
造模后1周采用随机数字表法将模型大鼠分为模型组及补阳还五汤（BYHWD）低、中、高剂量组，加上假手术组共5组。补阳还五汤低、中、高剂量组分别按9.25、18.50、37.00 g/（kg·d）给予补阳还五汤水煎剂灌胃（分别相当于1、2、4倍生物等效剂量）；假手术组、模型组给予0.2 mL/10 g生理盐水灌胃。造模13周末，水合氯醛麻醉大鼠，经腹主动脉注射10%氯化钾注射液处死，4%中性甲醛固定心肌用于组织病理学检测，-80 ℃保存心肌用于Westren blot检测。
2.3 免疫组化检测
采用免疫组化法检测心肌Ⅷ因子及VEGF-C表达，按免疫组化试剂盒说明操作，常规制作石蜡切片，按程序脱蜡至水，3%H2O2灭活内源性酶，微波抗原修复，BSA封闭液封闭，加入兔抗大鼠Ⅷ因子多克隆抗体（1∶100）、兔抗大鼠VEGF-C抗体（1∶100），4 ℃孵育过夜，次日加羊抗兔IgG/HRP抗体（1∶100），DAB显色，封片。利用尼康Eclipse Ti-S光学显微镜放大（×400倍），每张切片随机选取5个视野摄取图像保存，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统计算每个图像的阳性细胞面积以及积分光密度值（IOD），用5个视野图像的均值表示每张切片的IOD值。
2.4 Westren blot检测
采用RIPA细胞裂解液提取组织蛋白，蛋白样品经12%SDS凝胶电泳后，转印至PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭1.5 h，分别与兔抗大鼠VEGF-C多克隆抗体（1∶300）、小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体（1∶5 000）4 ℃孵育过夜；再分别与相应二抗羊抗兔IgG/HRP（1∶3 000）、羊抗小鼠IgG/HRP（1∶3 000） 37 ℃孵育1 h，用化学发光法在Kodak 2 000 MM图像工作站成像， VEGF-C与β-actin条带的光密度比值表示VEGF-C的相对表达水平。 3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以—x±s表示。首先对数据进行方差齐性检验，方差齐则应用方差进行组间两两比较；如果方差不齐，则应用Welch法进行检验，应用T2法进行两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般状态
共制作心肌梗死模型大鼠75只，术后1周内死亡12只。取存活大鼠60只，每组12只，分组给药后，模型组死亡2只，补阳还五汤低剂量组死亡1只，假手术组及补阳还五汤中、高剂量组无死亡。大鼠死因推测为心衰、心脏破裂及术后感染。
4.2 补阳还五汤对心肌血管密度与血管内皮细胞生长因子-C表达的影响（见表1、图1～图3）
5 讨论
通过对心肌梗死后患者中医证候的临床观察，我们发现心肌梗死后心室重构为本虚标实之证，正气不足为其内伤基础，气滞血瘀为其发病的直接原因，气虚血瘀为其主要病理机制。因此，在治疗上我们将益气活血作为心肌梗死后治疗基本大法，采用清代名医王清任的益气活血代表方补阳还五汤进行治疗，效果较佳[1]。
既往研究表明，心肌梗死后肥大心肌组织中出现微血管密度降低，引起心肌缺氧、代谢效率降低、心肌数量减少、心肌纤维化以及收缩功能障碍[2-4]。本研究中发现，造模3个月后模型组心肌微血管密度较假手术组显著下降，与既往研究结果一致。VEGF是血小板衍生生长因子家族中的一员，具有刺激血管内皮细胞发生有丝分裂和血管生成的功能[5]。VEGF在心肌梗死后心肌血管新生中起重要作用，VEGF的表达与缺血心肌组织血管新生呈正相关，抑制VEGF表达加快压力负荷诱导左室重构的发展[6-7]。本研究应用冠状动脉结扎造成大鼠心肌梗死模型，对补阳还五汤促进梗死边缘区VEGF-C表达进行研究，结果显示，补阳还五汤能促进梗死边缘区心肌组织微血管的生长和VEGF-C的表达，效果呈剂量依赖性，提示补阳还五汤促进心肌微血管生成的作用可能与激活VEGF-C有关。
参考文献：
[1] 郑锵，周迎春.补阳还五汤改善心梗后心室重构大鼠左室功能的研究[J].新中医，2010，42（6）：109-110.
[2] Wang G， Hamid T， Keith RJ， et al. Cardioprotective and antiapoptotic effects of heme oxygenase-1 in the failing heart[J]. Circulation，2010，121（17）：1912-1925.
[3] Shiojima I， Sato K， Izumiya Y， et al. Disruption of coordinated cardiac hypertrophy and angiogenesis contributes to the transition to heart failure[J]. J Clin Invest，2005，115（8）：2108-2118.
[4] De Boer RA， Pinto YM， Van Veldhuisen DJ. The imbalance between oxygen demand and supply as a potential mechanism in the pathophysiology of heart failure：the role of microvascular growth and abnormalities[J]. Microcirculation，2003，10（2）：113-126.
[5] Xu XH， Xu J， Xue L， et al. VEGF attenuates development from cardiac hypertrophy to heart failure after aortic stenosis through mitochondrial mediated apoptosis and cardiomyocyte proliferation[J]. J Cardiothorac Surg，2011，6：54.
[6] Asaumi Y， Kagaya Y， Takeda M， et al. Protective role of endogenous erythropoietin system in nonhematopoietic cells against pressure overload-induced left ventricular dysfunction in mice[J]. Circulation，2007，115（15）：2022-2032.
[7] Westenbrink BD， Lipsic E， van der Meer P， et al. Erythropoietin improves cardiac function through endothelial progenitor cell and vascular endothelial growth factor mediated neovascularization[J]. Eur Heart J，2007，28（16）：2018-2027.
（收稿日期：2012-03-23，编辑：华强）
关键词：补阳还五汤；心肌梗死；血管新生；血管内皮细胞生长因子-C；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.010
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0024-03
Key words：Buyanghuanwu decoction；myocardial infarction；blood vessel neogenesis；VEGF-C；rats
目前，虽然介入治疗结合急性心肌梗死后多重危险因素综合控制对于多数患者可增加冠状动脉灌注，提高心肌梗死急性期的治疗效果，改善患者的远期预后，但对冠状动脉纤细和病
变弥散的患者而言，这些治疗手段则难以奏效，无法恢复有效血运。心肌梗死仍是心血管病事件死亡的主要原因之一，心肌梗死后的血运重建仍是抗心肌缺血的主要问题。本研究采用结扎冠脉大鼠模型，探讨补阳还五汤对促进心肌微血管生成作用及其机制，以期为补阳还五汤的临床运用提供实验证据。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性Wistar大鼠75只，体质量150～200 g，南方医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（粤）2006- 0015。
1.2 药物
补阳还五汤按王清任《医林改错》原方组成剂量稍作调整：黄芪30 g，当归尾10 g，赤芍10 g，地龙10 g，川芎10 g，红花10 g，桃仁10 g。药材由广州市药材公司提供。将上述原药材去除杂质，按组方剂量配制混合，蒸馏水浸泡30 min后，用TC-15套式恒温器250 V电压加热煎煮。沸腾后将电压调低至200 V煎煮1 h，过滤得第1次煎液；药渣再加水5 000 mL，煎煮方法同前，过滤得第2次煎液。取两次滤液合并，80 ℃水浴蒸发浓缩至原药材1 g/mL 4 ℃冰箱保存，临用前充分摇匀并加热至室温。
1.3 仪器与试剂
江湾Ⅰ型人工呼吸机，第二军医大学仪器厂；尼康Eclipse Ti-S荧光倒置显微镜，日本尼康公司；Kodak 2 000 MM图像工作站，美国柯达公司。异氟醚购自山东力诺科峰制药有限公司，免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自鼎国生物技术有限公司，抗大鼠血管内皮细胞生长因子-C（VEGF-C）多克隆抗体、羊抗兔IgG/HRP抗体、羊抗小鼠IgG/HRP抗体购自武汉博士德生物技术有限公司，兔抗大鼠Ⅷ因子多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体购自艾比玛特生物医药有限公司，ECL化学发光试剂购自Millipore公司。
2 实验方法
2.1 动物模型制备
按文献[1]方法结扎左冠状动脉主干造成心肌梗死模型。在左冠状动脉起源点下1～2 mm处，结扎左冠状动脉主干，标准肢体导联Ⅱ导ST段抬高，肉眼观察结扎区变白，迅速将心脏放回胸腔，随即缝合肌肉和皮肤，将胸腔内的空气及血液抽尽。术后每隔10 min复查1次心电图，如连续3次ST段抬高即为急性心肌梗死造模成功。假手术组除不结扎冠状动脉外，其余操作与模型组动物相同。术后肌注青霉素4万U，1次/d，共3 d。
2.2 分组与给药
造模后1周采用随机数字表法将模型大鼠分为模型组及补阳还五汤（BYHWD）低、中、高剂量组，加上假手术组共5组。补阳还五汤低、中、高剂量组分别按9.25、18.50、37.00 g/（kg·d）给予补阳还五汤水煎剂灌胃（分别相当于1、2、4倍生物等效剂量）；假手术组、模型组给予0.2 mL/10 g生理盐水灌胃。造模13周末，水合氯醛麻醉大鼠，经腹主动脉注射10%氯化钾注射液处死，4%中性甲醛固定心肌用于组织病理学检测，-80 ℃保存心肌用于Westren blot检测。
2.3 免疫组化检测
采用免疫组化法检测心肌Ⅷ因子及VEGF-C表达，按免疫组化试剂盒说明操作，常规制作石蜡切片，按程序脱蜡至水，3%H2O2灭活内源性酶，微波抗原修复，BSA封闭液封闭，加入兔抗大鼠Ⅷ因子多克隆抗体（1∶100）、兔抗大鼠VEGF-C抗体（1∶100），4 ℃孵育过夜，次日加羊抗兔IgG/HRP抗体（1∶100），DAB显色，封片。利用尼康Eclipse Ti-S光学显微镜放大（×400倍），每张切片随机选取5个视野摄取图像保存，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统计算每个图像的阳性细胞面积以及积分光密度值（IOD），用5个视野图像的均值表示每张切片的IOD值。
2.4 Westren blot检测
采用RIPA细胞裂解液提取组织蛋白，蛋白样品经12%SDS凝胶电泳后，转印至PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭1.5 h，分别与兔抗大鼠VEGF-C多克隆抗体（1∶300）、小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体（1∶5 000）4 ℃孵育过夜；再分别与相应二抗羊抗兔IgG/HRP（1∶3 000）、羊抗小鼠IgG/HRP（1∶3 000） 37 ℃孵育1 h，用化学发光法在Kodak 2 000 MM图像工作站成像， VEGF-C与β-actin条带的光密度比值表示VEGF-C的相对表达水平。 3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以—x±s表示。首先对数据进行方差齐性检验，方差齐则应用方差进行组间两两比较；如果方差不齐，则应用Welch法进行检验，应用T2法进行两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般状态
共制作心肌梗死模型大鼠75只，术后1周内死亡12只。取存活大鼠60只，每组12只，分组给药后，模型组死亡2只，补阳还五汤低剂量组死亡1只，假手术组及补阳还五汤中、高剂量组无死亡。大鼠死因推测为心衰、心脏破裂及术后感染。
4.2 补阳还五汤对心肌血管密度与血管内皮细胞生长因子-C表达的影响（见表1、图1～图3）
5 讨论
通过对心肌梗死后患者中医证候的临床观察，我们发现心肌梗死后心室重构为本虚标实之证，正气不足为其内伤基础，气滞血瘀为其发病的直接原因，气虚血瘀为其主要病理机制。因此，在治疗上我们将益气活血作为心肌梗死后治疗基本大法，采用清代名医王清任的益气活血代表方补阳还五汤进行治疗，效果较佳[1]。
既往研究表明，心肌梗死后肥大心肌组织中出现微血管密度降低，引起心肌缺氧、代谢效率降低、心肌数量减少、心肌纤维化以及收缩功能障碍[2-4]。本研究中发现，造模3个月后模型组心肌微血管密度较假手术组显著下降，与既往研究结果一致。VEGF是血小板衍生生长因子家族中的一员，具有刺激血管内皮细胞发生有丝分裂和血管生成的功能[5]。VEGF在心肌梗死后心肌血管新生中起重要作用，VEGF的表达与缺血心肌组织血管新生呈正相关，抑制VEGF表达加快压力负荷诱导左室重构的发展[6-7]。本研究应用冠状动脉结扎造成大鼠心肌梗死模型，对补阳还五汤促进梗死边缘区VEGF-C表达进行研究，结果显示，补阳还五汤能促进梗死边缘区心肌组织微血管的生长和VEGF-C的表达，效果呈剂量依赖性，提示补阳还五汤促进心肌微血管生成的作用可能与激活VEGF-C有关。
参考文献：
[1] 郑锵，周迎春.补阳还五汤改善心梗后心室重构大鼠左室功能的研究[J].新中医，2010，42（6）：109-110.
[2] Wang G， Hamid T， Keith RJ， et al. Cardioprotective and antiapoptotic effects of heme oxygenase-1 in the failing heart[J]. Circulation，2010，121（17）：1912-1925.
[3] Shiojima I， Sato K， Izumiya Y， et al. Disruption of coordinated cardiac hypertrophy and angiogenesis contributes to the transition to heart failure[J]. J Clin Invest，2005，115（8）：2108-2118.
[4] De Boer RA， Pinto YM， Van Veldhuisen DJ. The imbalance between oxygen demand and supply as a potential mechanism in the pathophysiology of heart failure：the role of microvascular growth and abnormalities[J]. Microcirculation，2003，10（2）：113-126.
[5] Xu XH， Xu J， Xue L， et al. VEGF attenuates development from cardiac hypertrophy to heart failure after aortic stenosis through mitochondrial mediated apoptosis and cardiomyocyte proliferation[J]. J Cardiothorac Surg，2011，6：54.
[6] Asaumi Y， Kagaya Y， Takeda M， et al. Protective role of endogenous erythropoietin system in nonhematopoietic cells against pressure overload-induced left ventricular dysfunction in mice[J]. Circulation，2007，115（15）：2022-2032.
[7] Westenbrink BD， Lipsic E， van der Meer P， et al. Erythropoietin improves cardiac function through endothelial progenitor cell and vascular endothelial growth factor mediated neovascularization[J]. Eur Heart J，2007，28（16）：2018-2027.
（收稿日期：2012-03-23，编辑：华强）