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【摘要】 目的：观察苦参碱对人慢性粒细胞白血病K562细胞的体外增值情况，探索潜在的分子机制。方法：显微镜下查看苦参碱对K562细胞的影响，联苯胺染色测定K562细胞的分化趋向，采用MTT法测定K562细胞在用药后的增殖抑制效应，通过流式细胞术以及双标记法测定K562细胞的周期变化和凋亡作用。结果：相较于阴性对照组，当苦参碱为0.05、0.10和0.20 mg/mL，K562细胞均呈现红系分化趋势，以0.05 mg/mL最为突出。MTT结果表明0.2、0.5和1.0 mg/mL对K562细胞表现出的生长抑制率依次为26.15%、45.90%和63.52%（P<0.01），有效浓度0.6 mg/mL。苦参碱能够将K562细胞定格于S期，抑制有丝分裂，诱导K562细胞快速地凋亡，0.2、0.5和1.0 mg/mL，对K562细胞的凋亡率依次为5.30%、62.13%与56.73%，明顯高于对照组细胞的1.67%（P<0.01）。结论：针对体外增殖的人慢粒K562细胞，苦参碱有明显的抑制效果，可诱导细胞红系分化，促进早期凋亡。
【关键词】 苦参碱; 慢性粒细胞白血病; K562细胞; 细胞分化; 细胞凋亡
【Abstract】 Objective：To observe the effect of matrine on human chronic leukemic cell lines K562 in vitro，and to explore the possible mechanism.Method：Morphological changes of K562 cells were observed by light microscopy.The tendency of K562 cells towards erythroid differentiation was detected by benzidine staining.The effect of matrine on the proliferation inhibition and the cell cycle of K562 were determined by MTT assay and flow cytometry，respectively.Annexin V-FITC/PI affinity assay was used to detect the apoptosis of K562 cells induced by matrine.Result：Compared to untreated K562 cells，the cells treated with matrine at the concentration of 0.05，0.10 and 0.20 mg/mL all exhibited erythroid differentiation and the effect of 0.05 mg/mL matrine was the most significant.The proliferation inhibitory rates were 26.15%，45.90% and 63.52% by MTT assay after treated with 0.2，0.5 and 1.0 mg/mL matrine，respectively.The median concentration of matrine was 0.6 mg/ml.Matrine can also block K562 cells cycle at the S stage，prevent the cells division from mitosis and induce the cells into apoptosis.About 5.30%，62.13% and 56.73% K562 cells were induced apoptosis with 0.2，0.5 and 1.0 mg/mL matrine treatment by the Annexin V-FITC/PI affinity assay，respectively，with a significant difference compared with the spontaneous apoptosis（1.67%）of the untreated cells（P<0.01）.Conclusion：Matrine can inhibit the proliferation of human CML K562 cells in vitro，induce erythroid differentiation and promote early apoptosis.
【Key words】 Matrine; Chronic myelocytic leukemia; K562 cell lines; Differentiation; Apoptosis
First-author’s address：The Third People’s Hospital of Huizhou，Huizhou 516000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.006
慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）作为一种血液恶性肿瘤，发病率较高。我国青少年中，CML也是最普遍的恶性肿瘤，它呈现高度增生、侵袭性高的生物学特征，慢粒防治长期为临床的重点。可见，找到新型的治疗方法与抗癌药物，对慢粒的临床治疗有深远的意义[1]。苦参碱（Matrine）最早源于传统中药典籍，是从苦参中提取而来的生物碱成分，有消炎、抗病毒、镇痛和抗心律失常等不同的药理学作用[2-3]。近年研究表明，它有显著的抗肿瘤活性，能够减少肿瘤细胞的过度增殖、恶性转移，加速凋亡或使其分化[4]。不过，苦参碱用于防治慢性白血病的分子机制尚未明确，需有更多的实验依据才能用于临床。本院选取人慢粒白血病K562细胞，通过体外细胞培养、流式细胞术等实验室方法评价了苦参碱对K562细胞的增殖效果，总结了潜在的作用机制。 1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
1.1.1 苦参碱 分子量248.36，纯度99.9%，由陕西省科学院化学研究所提供。使用双蒸水配备10 g/L储存液，在-20 ℃下进行储存。
1.1.2 细胞株及培养 人慢性粒细胞白血病K562细胞株，由中国科学院上海细胞所负责提供，在RPMI 1640培养基[10%小牛血清（FCS）+青、链霉素（浓度依次为100 U/mL、100 μg/mL）]中，进行传代培养。
1.1.3 主要试剂和仪器 RPMI 1640培养基：GIBCO产品（美）+三蒸水（ddH2O）进行配备，0.22 μm滤膜抽滤灭菌，于4 ℃下进行存储。小牛血清（FCS）均由杭州四季青生物研究所提供。溴化-（4，-5二甲基噻唑-2）-2、台盼蓝染液均是由美国Sigma公司提供。Annexin V-FITC Kit，由晶美生物工程公司负责供应。细胞培养板：Corning公司（美）。CO2培养箱：Heraeus公司（德）;超净工作台：源自苏州净化设备厂;低温离心机：Hitachi Himal，LF15型，日本;纯水仪：Milli-Q Academic Water Purification Sys（美）;全自动酶标仪（Bio-Rad Model 680型）;流式细胞仪：Beckon Dickinson公司（美）。
1.2 实验方法及检测指标
1.2.1 形态学观察 苦参碱前后，观察倒置光学显微镜下细胞自身的形态学变化。
1.2.2 联苯胺染色 对数生长期K562细胞，细胞浓度调至6×104/mL，掺加6孔细胞培养板中，每孔1 mL。实验组：掺加苦参碱药液，终浓度依次为0.05、0.10以及0.20 mg/mL;阴性对照组：掺加等体积RPMI 1640培養液。将细胞培养板放入到37 ℃下，湿度饱和，5%比例的CO2培养箱中进行培养，每隔2～3天对RPMI 1640培养基进行更换，药物浓度一致。6 d后搜集细胞来完成联苯胺染色，以200个细胞为例，在显微镜下观察染色阳性细胞的个数，计算出联苯胺染色阳性率。
1.2.3 苦参碱对K562细胞作用浓度-时间曲线的测定 搜集对数生长期K562细胞，将细胞浓度调至1.8×105/mL，掺加到12孔细胞培养板，每孔1 mL。实验组：掺加苦参碱药液，终浓度依次为0.2，0.5以及1.0 mg/mL。阴性对照组：掺入人等体积RPMI 1640培养液，各种浓度均设计6个平行孔。将细胞培养板放入到37 ℃下，湿度均饱和，5%浓度的CO2培养箱中开始培养。每组选择1孔，运用台盼蓝拒染法来对活细胞数进行计算，接连6 d，查看不同时段、各种浓度苦参碱对K562细胞生长产生的不同影响。
1.2.4 MTT增殖实验 搜集对数生长期K562细胞，将细胞浓度调至6×104/mL，在96孔板中进行接种，200 μL/孔。实验组：将苦参碱药液掺加到细胞中，终浓度依次为0.2、0.5以及1.0 mg/mL。阴性对照组：不掺入苦参碱药液。空白对照组：掺加等体积RPMI 1640培养基，每个小组设计8个独立的平行孔。在37 ℃下摆放培养板，湿度适中，5%浓度的 CO2培养箱中进行培养，时间44 h，对细胞上清液150 μL进行离心，每孔掺入RPMI 1640 培养基200 μL;5 mg/mL MTT溶液20 μL，接连培养4 h，将上清150 μL予以倒出，掺加二甲基亚砜200 μL，振荡5 min确保蓝色结晶可以溶解;充分混匀，利用酶标仪来读取吸光度值（A570）。细胞生长抑制率（%）=（1-实验组A570均值/对照组A570均值）×100%
1.2.5 细胞周期分析 搜集对数生长期K562细胞，将细胞浓度调至3.5×105/mL，掺加到6孔细胞培养板，每孔1 mL。实验组：掺加苦参碱药液，终浓度依次为0.2、0.5以及1.0 mg/mL。阴性对照组：掺入人等体积RPMI 1640培养液，各种浓度均设计6个平行孔。将细胞培养板放入到37 ℃下，湿度均饱和，5%浓度的CO2培养箱中开始培养。离心处理后搜集细胞，使用PBS进行洗涤，后用70%冷乙醇加以固定。碘化丙啶（PI）在室温条件下染色30 min，利用流式细胞仪来测定细胞的周期变化和时相，得到细胞增殖指数（PI）。PI（%）=（S+G2/M）/（G1+S+G2/M）×100%
1.2.6 Annexin V-FITC/PI 双标记法检测细胞早期凋亡 搜集对数生长期K562细胞，将细胞浓度调至3.5×105/mL，在6孔板中进行接种，200 μL/孔。实验组：将苦参碱药液掺加到细胞中，终浓度依次为0.2、0.5以及1.0 mg/mL。阴性对照组：不掺入苦参碱药液;空白对照组：掺加等体积RPMI 1640培养基。在37 ℃下摆放培养板，湿度适中，5%浓度的CO2培养箱中进行培养，时间48 h，离心处理后收集细胞，将其在缓冲液中进行悬浮，FITC标记Annexin V以及PI在常温下孵育，大约10 min，利用流式细胞仪来测定细胞的凋亡状态。
1.3 统计学处理 使用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，行单因素方差分析，比较采用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 形态学观察 未用药K562细胞，呈现悬浮的生长状态，外形圆，胞浆颗粒少，有时可见空泡;经处理后，胞体显著的变小，核染色质也开始密闭，核仁逐渐消失，此时细胞成呈现为串珠样，出现了非常多的细胞碎片或是出芽细胞。
2.2 联苯胺染色 经过0.05、0.10以及0.20 mg/mL苦参碱作用，阳性细胞的百分比依次为10%，4%以及3%，不同浓度下K562细胞均呈现了红系分化的走向，以0.05 mg/mL浓度最为突出。 2.3 苦參碱对K562细胞的增殖抑制作用 从图1看出，苦参碱浓度变大后，K562细胞自身的增殖率会慢慢地递减;时间越长，该趋势也会下降。可见苦参碱的抑制作用，对剂量-时间有较强的依赖性。从图2、表1中看出，0.2、0.5和1.0 mg/mL苦参碱经过48 h作用后，K562细胞生长也将明显地被抑制，抑制率依次为（26.15±5.46）%、（45.9±3.59）%与（63.52±3.12）%，其中有效浓度0.6 mg/mL，基本符合生长曲线。
2.4 不同浓度苦参碱对K562细胞周期的影响 从表2和图3、4中发现，0.2 mg/mL苦参碱能够抑制G0/G1期细胞，使S期细胞明显地扩增。当苦参碱浓度变大，G0/G1期细胞也会明显地减少，而S期细胞反倒会增多。说明苦参碱能够将K562细胞的周期明显地阻滞于S期，延缓G2/M期进程，防止细胞过多地有丝分裂，加速细胞凋亡。
2.5 苦参碱对K562细胞的诱导凋亡的作用 从图5不难看出，0.2、0.5以及1.0 mg/mL的苦参碱，诱导K562细胞的凋亡百分率依次为5.30%、62.13%以及56.73%，相较于对照组细胞原本的自发凋亡率1.67%明显更高，以0.5 mg/mL苦参碱尤为突出。当苦参碱自身的作用浓度及其时间延长后，K562细胞的坏死占比也在提升。但是，凋亡细胞占比并未随之上升，这可能是由苦参碱的作用时间及其浓度所致。浓度较高或时间较长，细胞更容易坏死，但不是凋亡。
3 讨论
肿瘤的出现，是由于多种基因的非正常表达，诱导细胞的过速增殖与凋亡抑制。故而，控制和预防肿瘤细胞的过速增殖、加速凋亡，这是临床治疗肿瘤的可靠方法。近些年，有人尝试从祖传医学中寻找新型的抗癌药物用于肿瘤的治疗。苦参碱，实际上是从苦参根中提取而来的活性成分。按照中国药典的记载，苦参碱能够达到抗病毒、消肿以及抗心律失常等多重不同的药理活性。如今，医学各界也开始关注苦参碱的抗癌效应。
研究发现苦参碱能够抑制人白血病细胞U937的增殖，诱导其凋亡，且作用呈剂量依赖性关系[5-7]。
苦参碱可上调白血病细胞表面部分NKG2D配体分子的表达，也可明显降低急性白血病患者血清sICAM-1、sVCAM-1水平，改善常规化疗药物疗效，促进患者康复[8-13]。本研究以细胞生长实验、细胞形态学以及Annexin V-FITC/PI双标记法等常见的实验方法，测定和对比了苦参碱对于在体外人慢粒白血病K562细胞生长特性的不同影响，得知苦参碱可以有效地抑制人K562细胞的过速生长，促使K562沿着红系方向开始分化，使细胞出现早期凋亡。MTT实验表明：0.2 mg/mL苦参碱能够防止K562细胞在体外过快地生长，其中有效浓度0.6 mg/mL。当浓度扩大后，苦参碱对于K562细胞生长表现出来的抑制效应与时间、剂量相关。本研究中0.2 mg/mL或更多的苦参碱，可以将K562细胞成功地阻滞于G1→S期，减小细胞原本的增殖指数（P<0.01）。在周期转换进程中，该指数比较关键。研究显示，多种抗癌药物均是对细胞周期内部的两个时相转换点G1→S以及G2→M进行阻断，来调控细胞周期，这主要是干扰周期蛋白自身的表达水平[14-16]。故而，笔者猜测苦参碱也能够抑制细胞中DNA的有效合成，减少有丝分裂，使K562细胞无法在体外过速地增殖。
光学显微镜下，笔者看到苦参碱应用后K562细胞表现出突出的凋亡特点，符合文献[17-19]报道。联苯胺染色法得知：0.05、0.10以及0.20 mg/mL苦参碱时，K562细胞呈现出红系分化的走向，0.05 mg/mL时尤为突出。研究发现，苦参碱诱导K562细胞走向分化、上调p27kipl蛋白表达，均是和减少蛋白依赖激酶（CDK）活性产生关联。p27kipl，是近来新找到的CDK抑制剂，又被叫作细胞凋亡促进因子，能够参与细胞分化[20-21]。除上述外，Annexin V-FITC/PI结果也提示：苦参碱处理能够促进K562细胞走向快速地凋亡（P<0.01）。
综上所述，诱导凋亡应该是苦参碱抑制K562细胞在体外过速增殖的分子机制。笔者从实验中也得出，当苦参碱自身的作用浓度及其时间增加后，K562细胞的凋亡率仍未变动，呈显著的剂量效应。不过，K562细胞自身的坏死率有所提升。推测原因：苦参碱的浓度及其作用时间，会带来不同的效应，高浓度或是作用时间长，细胞更容易坏死而不是凋亡。与低浓度或是短时间作用相比，细胞结构及其生物学功能更容易变化。如凋亡，而不是整体结构或是功能的完全丧失。本研究对临床用药或有一定的指导意义。
参考文献
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（收稿日期：2018-07-10） （本文編辑：周亚杰）
【关键词】 苦参碱; 慢性粒细胞白血病; K562细胞; 细胞分化; 细胞凋亡
【Abstract】 Objective：To observe the effect of matrine on human chronic leukemic cell lines K562 in vitro，and to explore the possible mechanism.Method：Morphological changes of K562 cells were observed by light microscopy.The tendency of K562 cells towards erythroid differentiation was detected by benzidine staining.The effect of matrine on the proliferation inhibition and the cell cycle of K562 were determined by MTT assay and flow cytometry，respectively.Annexin V-FITC/PI affinity assay was used to detect the apoptosis of K562 cells induced by matrine.Result：Compared to untreated K562 cells，the cells treated with matrine at the concentration of 0.05，0.10 and 0.20 mg/mL all exhibited erythroid differentiation and the effect of 0.05 mg/mL matrine was the most significant.The proliferation inhibitory rates were 26.15%，45.90% and 63.52% by MTT assay after treated with 0.2，0.5 and 1.0 mg/mL matrine，respectively.The median concentration of matrine was 0.6 mg/ml.Matrine can also block K562 cells cycle at the S stage，prevent the cells division from mitosis and induce the cells into apoptosis.About 5.30%，62.13% and 56.73% K562 cells were induced apoptosis with 0.2，0.5 and 1.0 mg/mL matrine treatment by the Annexin V-FITC/PI affinity assay，respectively，with a significant difference compared with the spontaneous apoptosis（1.67%）of the untreated cells（P<0.01）.Conclusion：Matrine can inhibit the proliferation of human CML K562 cells in vitro，induce erythroid differentiation and promote early apoptosis.
【Key words】 Matrine; Chronic myelocytic leukemia; K562 cell lines; Differentiation; Apoptosis
First-author’s address：The Third People’s Hospital of Huizhou，Huizhou 516000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.006
慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）作为一种血液恶性肿瘤，发病率较高。我国青少年中，CML也是最普遍的恶性肿瘤，它呈现高度增生、侵袭性高的生物学特征，慢粒防治长期为临床的重点。可见，找到新型的治疗方法与抗癌药物，对慢粒的临床治疗有深远的意义[1]。苦参碱（Matrine）最早源于传统中药典籍，是从苦参中提取而来的生物碱成分，有消炎、抗病毒、镇痛和抗心律失常等不同的药理学作用[2-3]。近年研究表明，它有显著的抗肿瘤活性，能够减少肿瘤细胞的过度增殖、恶性转移，加速凋亡或使其分化[4]。不过，苦参碱用于防治慢性白血病的分子机制尚未明确，需有更多的实验依据才能用于临床。本院选取人慢粒白血病K562细胞，通过体外细胞培养、流式细胞术等实验室方法评价了苦参碱对K562细胞的增殖效果，总结了潜在的作用机制。 1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
1.1.1 苦参碱 分子量248.36，纯度99.9%，由陕西省科学院化学研究所提供。使用双蒸水配备10 g/L储存液，在-20 ℃下进行储存。
1.1.2 细胞株及培养 人慢性粒细胞白血病K562细胞株，由中国科学院上海细胞所负责提供，在RPMI 1640培养基[10%小牛血清（FCS）+青、链霉素（浓度依次为100 U/mL、100 μg/mL）]中，进行传代培养。
1.1.3 主要试剂和仪器 RPMI 1640培养基：GIBCO产品（美）+三蒸水（ddH2O）进行配备，0.22 μm滤膜抽滤灭菌，于4 ℃下进行存储。小牛血清（FCS）均由杭州四季青生物研究所提供。溴化-（4，-5二甲基噻唑-2）-2、台盼蓝染液均是由美国Sigma公司提供。Annexin V-FITC Kit，由晶美生物工程公司负责供应。细胞培养板：Corning公司（美）。CO2培养箱：Heraeus公司（德）;超净工作台：源自苏州净化设备厂;低温离心机：Hitachi Himal，LF15型，日本;纯水仪：Milli-Q Academic Water Purification Sys（美）;全自动酶标仪（Bio-Rad Model 680型）;流式细胞仪：Beckon Dickinson公司（美）。
1.2 实验方法及检测指标
1.2.1 形态学观察 苦参碱前后，观察倒置光学显微镜下细胞自身的形态学变化。
1.2.2 联苯胺染色 对数生长期K562细胞，细胞浓度调至6×104/mL，掺加6孔细胞培养板中，每孔1 mL。实验组：掺加苦参碱药液，终浓度依次为0.05、0.10以及0.20 mg/mL;阴性对照组：掺加等体积RPMI 1640培養液。将细胞培养板放入到37 ℃下，湿度饱和，5%比例的CO2培养箱中进行培养，每隔2～3天对RPMI 1640培养基进行更换，药物浓度一致。6 d后搜集细胞来完成联苯胺染色，以200个细胞为例，在显微镜下观察染色阳性细胞的个数，计算出联苯胺染色阳性率。
1.2.3 苦参碱对K562细胞作用浓度-时间曲线的测定 搜集对数生长期K562细胞，将细胞浓度调至1.8×105/mL，掺加到12孔细胞培养板，每孔1 mL。实验组：掺加苦参碱药液，终浓度依次为0.2，0.5以及1.0 mg/mL。阴性对照组：掺入人等体积RPMI 1640培养液，各种浓度均设计6个平行孔。将细胞培养板放入到37 ℃下，湿度均饱和，5%浓度的CO2培养箱中开始培养。每组选择1孔，运用台盼蓝拒染法来对活细胞数进行计算，接连6 d，查看不同时段、各种浓度苦参碱对K562细胞生长产生的不同影响。
1.2.4 MTT增殖实验 搜集对数生长期K562细胞，将细胞浓度调至6×104/mL，在96孔板中进行接种，200 μL/孔。实验组：将苦参碱药液掺加到细胞中，终浓度依次为0.2、0.5以及1.0 mg/mL。阴性对照组：不掺入苦参碱药液。空白对照组：掺加等体积RPMI 1640培养基，每个小组设计8个独立的平行孔。在37 ℃下摆放培养板，湿度适中，5%浓度的 CO2培养箱中进行培养，时间44 h，对细胞上清液150 μL进行离心，每孔掺入RPMI 1640 培养基200 μL;5 mg/mL MTT溶液20 μL，接连培养4 h，将上清150 μL予以倒出，掺加二甲基亚砜200 μL，振荡5 min确保蓝色结晶可以溶解;充分混匀，利用酶标仪来读取吸光度值（A570）。细胞生长抑制率（%）=（1-实验组A570均值/对照组A570均值）×100%
1.2.5 细胞周期分析 搜集对数生长期K562细胞，将细胞浓度调至3.5×105/mL，掺加到6孔细胞培养板，每孔1 mL。实验组：掺加苦参碱药液，终浓度依次为0.2、0.5以及1.0 mg/mL。阴性对照组：掺入人等体积RPMI 1640培养液，各种浓度均设计6个平行孔。将细胞培养板放入到37 ℃下，湿度均饱和，5%浓度的CO2培养箱中开始培养。离心处理后搜集细胞，使用PBS进行洗涤，后用70%冷乙醇加以固定。碘化丙啶（PI）在室温条件下染色30 min，利用流式细胞仪来测定细胞的周期变化和时相，得到细胞增殖指数（PI）。PI（%）=（S+G2/M）/（G1+S+G2/M）×100%
1.2.6 Annexin V-FITC/PI 双标记法检测细胞早期凋亡 搜集对数生长期K562细胞，将细胞浓度调至3.5×105/mL，在6孔板中进行接种，200 μL/孔。实验组：将苦参碱药液掺加到细胞中，终浓度依次为0.2、0.5以及1.0 mg/mL。阴性对照组：不掺入苦参碱药液;空白对照组：掺加等体积RPMI 1640培养基。在37 ℃下摆放培养板，湿度适中，5%浓度的CO2培养箱中进行培养，时间48 h，离心处理后收集细胞，将其在缓冲液中进行悬浮，FITC标记Annexin V以及PI在常温下孵育，大约10 min，利用流式细胞仪来测定细胞的凋亡状态。
1.3 统计学处理 使用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，行单因素方差分析，比较采用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 形态学观察 未用药K562细胞，呈现悬浮的生长状态，外形圆，胞浆颗粒少，有时可见空泡;经处理后，胞体显著的变小，核染色质也开始密闭，核仁逐渐消失，此时细胞成呈现为串珠样，出现了非常多的细胞碎片或是出芽细胞。
2.2 联苯胺染色 经过0.05、0.10以及0.20 mg/mL苦参碱作用，阳性细胞的百分比依次为10%，4%以及3%，不同浓度下K562细胞均呈现了红系分化的走向，以0.05 mg/mL浓度最为突出。 2.3 苦參碱对K562细胞的增殖抑制作用 从图1看出，苦参碱浓度变大后，K562细胞自身的增殖率会慢慢地递减;时间越长，该趋势也会下降。可见苦参碱的抑制作用，对剂量-时间有较强的依赖性。从图2、表1中看出，0.2、0.5和1.0 mg/mL苦参碱经过48 h作用后，K562细胞生长也将明显地被抑制，抑制率依次为（26.15±5.46）%、（45.9±3.59）%与（63.52±3.12）%，其中有效浓度0.6 mg/mL，基本符合生长曲线。
2.4 不同浓度苦参碱对K562细胞周期的影响 从表2和图3、4中发现，0.2 mg/mL苦参碱能够抑制G0/G1期细胞，使S期细胞明显地扩增。当苦参碱浓度变大，G0/G1期细胞也会明显地减少，而S期细胞反倒会增多。说明苦参碱能够将K562细胞的周期明显地阻滞于S期，延缓G2/M期进程，防止细胞过多地有丝分裂，加速细胞凋亡。
2.5 苦参碱对K562细胞的诱导凋亡的作用 从图5不难看出，0.2、0.5以及1.0 mg/mL的苦参碱，诱导K562细胞的凋亡百分率依次为5.30%、62.13%以及56.73%，相较于对照组细胞原本的自发凋亡率1.67%明显更高，以0.5 mg/mL苦参碱尤为突出。当苦参碱自身的作用浓度及其时间延长后，K562细胞的坏死占比也在提升。但是，凋亡细胞占比并未随之上升，这可能是由苦参碱的作用时间及其浓度所致。浓度较高或时间较长，细胞更容易坏死，但不是凋亡。
3 讨论
肿瘤的出现，是由于多种基因的非正常表达，诱导细胞的过速增殖与凋亡抑制。故而，控制和预防肿瘤细胞的过速增殖、加速凋亡，这是临床治疗肿瘤的可靠方法。近些年，有人尝试从祖传医学中寻找新型的抗癌药物用于肿瘤的治疗。苦参碱，实际上是从苦参根中提取而来的活性成分。按照中国药典的记载，苦参碱能够达到抗病毒、消肿以及抗心律失常等多重不同的药理活性。如今，医学各界也开始关注苦参碱的抗癌效应。
研究发现苦参碱能够抑制人白血病细胞U937的增殖，诱导其凋亡，且作用呈剂量依赖性关系[5-7]。
苦参碱可上调白血病细胞表面部分NKG2D配体分子的表达，也可明显降低急性白血病患者血清sICAM-1、sVCAM-1水平，改善常规化疗药物疗效，促进患者康复[8-13]。本研究以细胞生长实验、细胞形态学以及Annexin V-FITC/PI双标记法等常见的实验方法，测定和对比了苦参碱对于在体外人慢粒白血病K562细胞生长特性的不同影响，得知苦参碱可以有效地抑制人K562细胞的过速生长，促使K562沿着红系方向开始分化，使细胞出现早期凋亡。MTT实验表明：0.2 mg/mL苦参碱能够防止K562细胞在体外过快地生长，其中有效浓度0.6 mg/mL。当浓度扩大后，苦参碱对于K562细胞生长表现出来的抑制效应与时间、剂量相关。本研究中0.2 mg/mL或更多的苦参碱，可以将K562细胞成功地阻滞于G1→S期，减小细胞原本的增殖指数（P<0.01）。在周期转换进程中，该指数比较关键。研究显示，多种抗癌药物均是对细胞周期内部的两个时相转换点G1→S以及G2→M进行阻断，来调控细胞周期，这主要是干扰周期蛋白自身的表达水平[14-16]。故而，笔者猜测苦参碱也能够抑制细胞中DNA的有效合成，减少有丝分裂，使K562细胞无法在体外过速地增殖。
光学显微镜下，笔者看到苦参碱应用后K562细胞表现出突出的凋亡特点，符合文献[17-19]报道。联苯胺染色法得知：0.05、0.10以及0.20 mg/mL苦参碱时，K562细胞呈现出红系分化的走向，0.05 mg/mL时尤为突出。研究发现，苦参碱诱导K562细胞走向分化、上调p27kipl蛋白表达，均是和减少蛋白依赖激酶（CDK）活性产生关联。p27kipl，是近来新找到的CDK抑制剂，又被叫作细胞凋亡促进因子，能够参与细胞分化[20-21]。除上述外，Annexin V-FITC/PI结果也提示：苦参碱处理能够促进K562细胞走向快速地凋亡（P<0.01）。
综上所述，诱导凋亡应该是苦参碱抑制K562细胞在体外过速增殖的分子机制。笔者从实验中也得出，当苦参碱自身的作用浓度及其时间增加后，K562细胞的凋亡率仍未变动，呈显著的剂量效应。不过，K562细胞自身的坏死率有所提升。推测原因：苦参碱的浓度及其作用时间，会带来不同的效应，高浓度或是作用时间长，细胞更容易坏死而不是凋亡。与低浓度或是短时间作用相比，细胞结构及其生物学功能更容易变化。如凋亡，而不是整体结构或是功能的完全丧失。本研究对临床用药或有一定的指导意义。
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（收稿日期：2018-07-10） （本文編辑：周亚杰）