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【中图分类号】R978.1 【文献标识码】A 【文章编号】1550-1868（2015）02
【摘 要】达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到。它能杀死临床上分离的绝大多数革兰阳性菌，具有广阔的应用前景。本实验确定了玫瑰链霉菌紫外诱变的处理时间为45s，链霉素对其的最低抑制浓度为2.1 μg/mL。通过对筛选得到的链霉素抗性菌株进行初筛和复筛，获得了一株达托霉素高产菌株NO. 201，其效价达到7652μg/mL，较对照组提高了90%。稳定性验证表明，该高产菌株传代5次仍然稳定，为后续生产提供了可能。
【关键词】达托霉素，玫瑰链霉菌，链霉素
1前言
达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到的脂肽类抗生素[1]。达托霉素在临床上表现出广谱、药效快、给药小、副反应小等优点[2]。
本文以紫外线诱变达托霉素生产菌株孢子悬浮液，筛选链霉素抗性菌株，获得了达托霉素高产菌株，并对获得的高产菌株的遗传特性及稳定性进行考察。
2实验方法
2.1 菌种
原始菌株由新昌制药厂菌种保藏中心保藏，作为诱变育种的出发菌株。
2.2 培养方法
取1 mL浓度为106个/ mL的孢子悬浮液接种种子培养基（30 mL/250 mL 摇瓶），30°C 250 r/min培养24 h至对数生长期；取2 mL种子液接种发酵培养基 （50 mL/500 mL 摇瓶） 30°C 250 r/min培养120 h，检测单位。
2.3 达托霉素的检测
采用Agilent 1200高效液相色谱仪测定。采用峰面积计算含量。
2.4 菌种诱变及筛选
2.4.1 单孢子悬浮液的制备
冷冻孢子移种于斜面，培养成熟后用灭过菌的0.85%LiCl溶液（做助变剂）制成孢子悬浮液，再用无菌玻璃珠将孢子充分打散，滤纸过滤，即得单孢子悬浮液。
2.4.2 紫外诱变处理
用吸管吸取5 mL孢子悬浮液于无菌平板中，置功率为30W，波长253.7nm的紫外灯下30 cm处开盖振荡照射一定时间，避光放置过夜，取样经梯度稀释后涂平板。
2.4.3链霉素耐受性突变株的筛选
2.4.3.1含链霉素的分离平板培养基的制备
在已灭菌的分离培养基中加入一定量的链霉素溶液，摇匀，倒平板，使成含一定浓度的链霉素平板。
2.4.3.2菌株对链霉素的耐受量的考察
将经紫外线处理后的单孢子悬浮液分别涂布于含不同浓度的链霉素平板培养基中培养，观察菌落的生长情况。
2.4.3.3链霉素耐受菌株的筛选
经紫外线处理后的单孢子悬浮液，经适当稀释后涂布于含一定浓度链霉素的分离平板上，待平板菌落培养成熟后，挑取若干株移种斜面。单菌落斜面长好后，经摇瓶二级发酵测定达托霉素的效价，效价高者立即制成冷冻管保存，同时进行复筛。
2.5高产菌株传代稳定性的研究
用群体传代的方法考察，最终筛选得到的高单位突变株的斜面传代稳定性。
3 结果与讨论
3.1 UV诱变处理结果
取5ml原始菌株单孢子悬浮液于无菌平板内，置紫外灯下开盖磁力搅拌照射，时间分别为15S、30S、45S、60S、90S、120S，然后分别稀释涂平板，放在30°C培养箱中培养6天后，对各个不同的紫外线处理时间平板进行菌落计数，结果显示随着紫外线照射时间的增加，菌体的死亡率上升，特别是当作用时间达到90S以上时，死亡率接近100%.一般紫外线做诱变剂时常采用杀菌率为70～80%的相对剂量[3]，因此我们选择45S作为诱变处理时间。
3.2链霉素耐受性突变株的筛选
产生抗生素的放线菌通常能生存在自身产生的抗生素环境中，对自身代谢产物的耐受性被看作是抗生素产生的重要因素。因此，在紫外诱变的基础上，本实验设计了耐受链霉素的筛选模型作理性化筛选。
3.2.1原始菌株对链霉素敏感性的考察
将经紫外线45S诱变处理后的单孢子悬浮液经适当稀释后，涂布于含不同浓度链霉素的分离平板上，实验结果链霉素对其最低抑制浓度为2.1μg/ml。
3.2.2链霉素耐受性突变株的选育
将经紫外线45S诱变处理后的单孢子悬浮液经适当稀释后，涂布在含有2.1μg/ml链霉素的分离平板上进行培养，并以未经诱变的单孢子悬浮液稀释涂与普通平板培养基上作对照。待平板菌落生长成熟后，挑取单菌落进行初筛和复筛工作，共进行三轮抗性菌株筛选，前后共获得352株抗链霉素菌株，其中大部分菌株产量较低，有9个单菌落的效价较高，最高的是No.201菌株，其平均效價达到7652 μ/ ml，较对照组提高了90%。
3.3 高产菌株NO. 201传代稳定性考察
用群代传代（斜面传斜面）的方法考察了NO. 201的斜面传代稳定性。菌株在斜面上连续传5代，每一代斜面均进行摇瓶二级发酵，即每代斜面接3只母瓶，每只母瓶接3只发酵瓶，共9只发酵瓶，发酵结束后分别用HPLC检测效价。菌株经斜面连续传接5代后，其生产能力没有出现明显退化，说明突变株NO. 201的高产遗传特性稳定。
参考文献
[1]
卜一珊， 崔蓉. 新的抗革兰阳性菌药物-达托霉素 [J]， 中国药师， 2005， （07）：66-68.
[2] 刘伯宁， 仓基勇， 张华. 达托霉素生产工艺及其衍生物组合生物合成 [J]， 中国生物工程杂志， 2010， （03）：119-124.
[3] 姚汝华，微生物工程工艺原理，华南理工大学出版社，2005，125～126.
【摘 要】达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到。它能杀死临床上分离的绝大多数革兰阳性菌，具有广阔的应用前景。本实验确定了玫瑰链霉菌紫外诱变的处理时间为45s，链霉素对其的最低抑制浓度为2.1 μg/mL。通过对筛选得到的链霉素抗性菌株进行初筛和复筛，获得了一株达托霉素高产菌株NO. 201，其效价达到7652μg/mL，较对照组提高了90%。稳定性验证表明，该高产菌株传代5次仍然稳定，为后续生产提供了可能。
【关键词】达托霉素，玫瑰链霉菌，链霉素
1前言
达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到的脂肽类抗生素[1]。达托霉素在临床上表现出广谱、药效快、给药小、副反应小等优点[2]。
本文以紫外线诱变达托霉素生产菌株孢子悬浮液，筛选链霉素抗性菌株，获得了达托霉素高产菌株，并对获得的高产菌株的遗传特性及稳定性进行考察。
2实验方法
2.1 菌种
原始菌株由新昌制药厂菌种保藏中心保藏，作为诱变育种的出发菌株。
2.2 培养方法
取1 mL浓度为106个/ mL的孢子悬浮液接种种子培养基（30 mL/250 mL 摇瓶），30°C 250 r/min培养24 h至对数生长期；取2 mL种子液接种发酵培养基 （50 mL/500 mL 摇瓶） 30°C 250 r/min培养120 h，检测单位。
2.3 达托霉素的检测
采用Agilent 1200高效液相色谱仪测定。采用峰面积计算含量。
2.4 菌种诱变及筛选
2.4.1 单孢子悬浮液的制备
冷冻孢子移种于斜面，培养成熟后用灭过菌的0.85%LiCl溶液（做助变剂）制成孢子悬浮液，再用无菌玻璃珠将孢子充分打散，滤纸过滤，即得单孢子悬浮液。
2.4.2 紫外诱变处理
用吸管吸取5 mL孢子悬浮液于无菌平板中，置功率为30W，波长253.7nm的紫外灯下30 cm处开盖振荡照射一定时间，避光放置过夜，取样经梯度稀释后涂平板。
2.4.3链霉素耐受性突变株的筛选
2.4.3.1含链霉素的分离平板培养基的制备
在已灭菌的分离培养基中加入一定量的链霉素溶液，摇匀，倒平板，使成含一定浓度的链霉素平板。
2.4.3.2菌株对链霉素的耐受量的考察
将经紫外线处理后的单孢子悬浮液分别涂布于含不同浓度的链霉素平板培养基中培养，观察菌落的生长情况。
2.4.3.3链霉素耐受菌株的筛选
经紫外线处理后的单孢子悬浮液，经适当稀释后涂布于含一定浓度链霉素的分离平板上，待平板菌落培养成熟后，挑取若干株移种斜面。单菌落斜面长好后，经摇瓶二级发酵测定达托霉素的效价，效价高者立即制成冷冻管保存，同时进行复筛。
2.5高产菌株传代稳定性的研究
用群体传代的方法考察，最终筛选得到的高单位突变株的斜面传代稳定性。
3 结果与讨论
3.1 UV诱变处理结果
取5ml原始菌株单孢子悬浮液于无菌平板内，置紫外灯下开盖磁力搅拌照射，时间分别为15S、30S、45S、60S、90S、120S，然后分别稀释涂平板，放在30°C培养箱中培养6天后，对各个不同的紫外线处理时间平板进行菌落计数，结果显示随着紫外线照射时间的增加，菌体的死亡率上升，特别是当作用时间达到90S以上时，死亡率接近100%.一般紫外线做诱变剂时常采用杀菌率为70～80%的相对剂量[3]，因此我们选择45S作为诱变处理时间。
3.2链霉素耐受性突变株的筛选
产生抗生素的放线菌通常能生存在自身产生的抗生素环境中，对自身代谢产物的耐受性被看作是抗生素产生的重要因素。因此，在紫外诱变的基础上，本实验设计了耐受链霉素的筛选模型作理性化筛选。
3.2.1原始菌株对链霉素敏感性的考察
将经紫外线45S诱变处理后的单孢子悬浮液经适当稀释后，涂布于含不同浓度链霉素的分离平板上，实验结果链霉素对其最低抑制浓度为2.1μg/ml。
3.2.2链霉素耐受性突变株的选育
将经紫外线45S诱变处理后的单孢子悬浮液经适当稀释后，涂布在含有2.1μg/ml链霉素的分离平板上进行培养，并以未经诱变的单孢子悬浮液稀释涂与普通平板培养基上作对照。待平板菌落生长成熟后，挑取单菌落进行初筛和复筛工作，共进行三轮抗性菌株筛选，前后共获得352株抗链霉素菌株，其中大部分菌株产量较低，有9个单菌落的效价较高，最高的是No.201菌株，其平均效價达到7652 μ/ ml，较对照组提高了90%。
3.3 高产菌株NO. 201传代稳定性考察
用群代传代（斜面传斜面）的方法考察了NO. 201的斜面传代稳定性。菌株在斜面上连续传5代，每一代斜面均进行摇瓶二级发酵，即每代斜面接3只母瓶，每只母瓶接3只发酵瓶，共9只发酵瓶，发酵结束后分别用HPLC检测效价。菌株经斜面连续传接5代后，其生产能力没有出现明显退化，说明突变株NO. 201的高产遗传特性稳定。
参考文献
[1]
卜一珊， 崔蓉. 新的抗革兰阳性菌药物-达托霉素 [J]， 中国药师， 2005， （07）：66-68.
[2] 刘伯宁， 仓基勇， 张华. 达托霉素生产工艺及其衍生物组合生物合成 [J]， 中国生物工程杂志， 2010， （03）：119-124.
[3] 姚汝华，微生物工程工艺原理，华南理工大学出版社，2005，125～126.