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【中图分类号】R465.5【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2015）04
前言
雷帕霉素（rapamycin），又名西罗莫司，是由吸水链霉菌种产生的水不溶性胞内产物，是一种三烯大环内酯抗生素[1]。雷帕霉素作为免疫抑制剂被用于器官移植排斥反应抑制、皮肤病、心脏病等领域，具有广阔的应用前景。但是国内外文献报道的雷帕霉素发酵生产能力较低，不具有工业化价值。本文将实验室保存的低产雷帕霉素菌株作为出发菌株，通过紫外吖啶橙复合诱变，辅以培养条件优化，大幅度提高了雷帕霉素产生菌的生产能力。摇瓶生产能力达到262ug/ml，比出发菌株高三倍多。
1 材料
斜面培养基：燕麦粉20g/l，琼脂20g/l
培养条件：28℃培养箱培养，在第三天观察，菌落直径约1-2mm，有少量白色孢子，从第七天开始孢子变成灰色，菌落直径在4-5mm左右，多为草帽形。培养至第10天。从斜面上挖1cm*1cm的菌块接母瓶。
母瓶培养基（%）：
葡萄糖1.5，豆饼粉1.0，氯化钠0.2，酵母粉0.5，玉米浆0.78，CaC03，0.1，
KH2PO4，0.2
液体发酵培养基（%）：
棉子饼粉2，葡萄糖3，酵母浸出粉0.5，KH2PO4 0. 5 ，硫酸铵0.5，黄豆饼粉0.2，氯化钠0.5，赖氨酸0.2。
2操作步骤
2.1 吖啶橙母液：准确称取0.3克吖啶橙粉末于250ml三角瓶中，加100ml水溶解，制成吖啶橙母液。
2.2 灭菌后每250ml的斜面培养基中分别加入0.5ml、1ml、1.5ml、2.5ml、5ml吖啶橙母液，（吖啶橙浓度为0.005%，0.01%，0.015%，0.025%，0.05%）倒平皿（约35ml/个）。平皿冷却后，于28摄氏度的空白培养箱中培养2天。湿度自然。.
3 孢子悬液制备
取培养好的10天左右的新鲜斜面一支，加入已灭菌的0.09%生理盐水10ml，用铲子小心刮下斜面孢子制成孢子悬液，将悬液移入无菌瓶中，玻璃珠振摇3～5min充分打散，以无菌擦镜纸过滤，收集过滤后的单孢子悬液，控制浓度为10-7/ml。
4 紫外诱变
取滤过的孢子悬液8m1分装于已灭菌的平底平皿中。先将15w的紫外灯打开，预热30min以上。调整照射距离，使灯距离平皿约30厘米，将平皿置于紫外照射区，打开皿盖，开始计时，边搅拌边照射，力求使孢子均匀吸收紫外光波。照射时间30秒。关闭紫外灯后，立即将处理样至于暗室，避免光修复。将紫外诱变过的孢子液依次稀释后，10-4，10-5，10-6分别涂布于不同浓度梯度的吖啶橙平皿上
1、与培养箱中培养十天后，统计紫外吖啶橙诱变复合诱变平皿上的单菌落个数，统计致死率。单菌落个数统计结果如下表所示：
根据致死率的实验结果，选取0.015%为该实验的诱变浓度，挑单菌落种母瓶，接发酵瓶，高效液相色谱法（HPLC）测单位。多次重复该实验。得到一株新菌RP20110722，摇瓶发酵效价高达143ug/ml，比出发菌株65ug/ml高120%左右。
5培养条件的优化
5.1前体物质对雷帕霉素发酵单位的影响
赖氨酸是雷帕霉素合成的前体之一，通过脱氨环化作用形成2-哌啶羧酸，在rapa合成酶催化作用下连接到聚酮链末端，中止链的延伸，并环化形成预-雷帕霉素。MS.lee等研究发现添加赖氨酸可以提高雷帕霉素的发酵水平。本实验改变了赖氨酸的添加浓度，考察不同添加量对雷帕霉素摇瓶发酵水平的影响。从表二可知，0.5g/l的添加浓度为最经济的添加浓度。从实验数据可知，菌种自身合成赖氨酸的能力很微弱，加入赖氨酸时，有利于菌的生长，达到0.5%时，超出需要，影响其他初级代谢，而使菌浓略显降低，抑制菌体生长。发酵酸性物质，使PH将至4.0左右。
5.2碳源对雷帕霉素发酵水平的影响
复合碳源可以解除葡萄糖效应的抑制作[2]，提高菌浓与发酵水平。首先观察在其他条件相同的情况下，在含有3%葡萄糖的培养基中，分别添加0.5%的甘油、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、糊精的效果。实验结果如图二所示：以3%G+0.5%甘油的效果做好。在此实验的基础上，进行了甘油的浓度添加实验。在原发酵培养基的基础上分别添加0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%的甘油。摸索甘油的最佳添加浓度。实验结果如图三所示，以0.75%的甘油添加量为最好。效价最高可达244ug/ml，比对照170ug/ml提高43%。
5.3培养基中微量元素对雷帕霉素发酵水平的影响。
微量元素是药物产生菌生长繁殖和代谢必需的物质，有文献报道[3]：一些无机盐对菌体的生和产物的积累有促进作用。有的包含在酶或辅酶的组成中，有的能活化各种酶。在特定的情况下，有的需单独加入，Co2+是甲基转移酶的载体，可以激活某些酶。Mn2+对微生物生长有一定的促进作用。本次实验考察了Co2+、Mn2+对雷帕霉素发酵水平的影响。结果如图四、图五所示。Co2+的添加浓度以0.015%为好，Mn2+的添加浓度以0.03%为最好。
6分析与讨论
结果表明，通过对吸水链霉菌的紫外吖啶橙复合诱变，得到了一株高产菌株RP20110722，使效价从65ug/ml提高到143ug/ml，再通过对培养基的优化，最终确定的发酵培养基为（%）：棉子饼粉2，葡萄糖3，甘油0.75，酵母浸出粉0.5，KH2PO4 0.5，硫酸铵0.5，黄豆饼粉0.2，氯化钠0.5，赖氨酸0.5，Co2+0.015%，Mn2+0.03%。使发酵单位提高到262ug/ml，比出发菌株提高了3倍多，取得了明显的效果，为后期的工业化生产奠定了较好的基础。
参考文献
[1]SEHGAL S N，BAKER H，VEZNA C，rapamysin（AY-22，989），a new antifiungal antibiotic II Femententation，isolation，and characterzation[J].，JAntibiot 1975 ，28（10：）726-727
[2]陈希扬等.培养条件优化和菌种选育提高雷帕霉素发酵水平.化学工程 2011年1月第39卷第一期
[3]BALTER M，Protein matchmaker may lead new gene the-rapy to the alter[j].science，1996，273（5272）：183
前言
雷帕霉素（rapamycin），又名西罗莫司，是由吸水链霉菌种产生的水不溶性胞内产物，是一种三烯大环内酯抗生素[1]。雷帕霉素作为免疫抑制剂被用于器官移植排斥反应抑制、皮肤病、心脏病等领域，具有广阔的应用前景。但是国内外文献报道的雷帕霉素发酵生产能力较低，不具有工业化价值。本文将实验室保存的低产雷帕霉素菌株作为出发菌株，通过紫外吖啶橙复合诱变，辅以培养条件优化，大幅度提高了雷帕霉素产生菌的生产能力。摇瓶生产能力达到262ug/ml，比出发菌株高三倍多。
1 材料
斜面培养基：燕麦粉20g/l，琼脂20g/l
培养条件：28℃培养箱培养，在第三天观察，菌落直径约1-2mm，有少量白色孢子，从第七天开始孢子变成灰色，菌落直径在4-5mm左右，多为草帽形。培养至第10天。从斜面上挖1cm*1cm的菌块接母瓶。
母瓶培养基（%）：
葡萄糖1.5，豆饼粉1.0，氯化钠0.2，酵母粉0.5，玉米浆0.78，CaC03，0.1，
KH2PO4，0.2
液体发酵培养基（%）：
棉子饼粉2，葡萄糖3，酵母浸出粉0.5，KH2PO4 0. 5 ，硫酸铵0.5，黄豆饼粉0.2，氯化钠0.5，赖氨酸0.2。
2操作步骤
2.1 吖啶橙母液：准确称取0.3克吖啶橙粉末于250ml三角瓶中，加100ml水溶解，制成吖啶橙母液。
2.2 灭菌后每250ml的斜面培养基中分别加入0.5ml、1ml、1.5ml、2.5ml、5ml吖啶橙母液，（吖啶橙浓度为0.005%，0.01%，0.015%，0.025%，0.05%）倒平皿（约35ml/个）。平皿冷却后，于28摄氏度的空白培养箱中培养2天。湿度自然。.
3 孢子悬液制备
取培养好的10天左右的新鲜斜面一支，加入已灭菌的0.09%生理盐水10ml，用铲子小心刮下斜面孢子制成孢子悬液，将悬液移入无菌瓶中，玻璃珠振摇3～5min充分打散，以无菌擦镜纸过滤，收集过滤后的单孢子悬液，控制浓度为10-7/ml。
4 紫外诱变
取滤过的孢子悬液8m1分装于已灭菌的平底平皿中。先将15w的紫外灯打开，预热30min以上。调整照射距离，使灯距离平皿约30厘米，将平皿置于紫外照射区，打开皿盖，开始计时，边搅拌边照射，力求使孢子均匀吸收紫外光波。照射时间30秒。关闭紫外灯后，立即将处理样至于暗室，避免光修复。将紫外诱变过的孢子液依次稀释后，10-4，10-5，10-6分别涂布于不同浓度梯度的吖啶橙平皿上
1、与培养箱中培养十天后，统计紫外吖啶橙诱变复合诱变平皿上的单菌落个数，统计致死率。单菌落个数统计结果如下表所示：
根据致死率的实验结果，选取0.015%为该实验的诱变浓度，挑单菌落种母瓶，接发酵瓶，高效液相色谱法（HPLC）测单位。多次重复该实验。得到一株新菌RP20110722，摇瓶发酵效价高达143ug/ml，比出发菌株65ug/ml高120%左右。
5培养条件的优化
5.1前体物质对雷帕霉素发酵单位的影响
赖氨酸是雷帕霉素合成的前体之一，通过脱氨环化作用形成2-哌啶羧酸，在rapa合成酶催化作用下连接到聚酮链末端，中止链的延伸，并环化形成预-雷帕霉素。MS.lee等研究发现添加赖氨酸可以提高雷帕霉素的发酵水平。本实验改变了赖氨酸的添加浓度，考察不同添加量对雷帕霉素摇瓶发酵水平的影响。从表二可知，0.5g/l的添加浓度为最经济的添加浓度。从实验数据可知，菌种自身合成赖氨酸的能力很微弱，加入赖氨酸时，有利于菌的生长，达到0.5%时，超出需要，影响其他初级代谢，而使菌浓略显降低，抑制菌体生长。发酵酸性物质，使PH将至4.0左右。
5.2碳源对雷帕霉素发酵水平的影响
复合碳源可以解除葡萄糖效应的抑制作[2]，提高菌浓与发酵水平。首先观察在其他条件相同的情况下，在含有3%葡萄糖的培养基中，分别添加0.5%的甘油、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、糊精的效果。实验结果如图二所示：以3%G+0.5%甘油的效果做好。在此实验的基础上，进行了甘油的浓度添加实验。在原发酵培养基的基础上分别添加0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%的甘油。摸索甘油的最佳添加浓度。实验结果如图三所示，以0.75%的甘油添加量为最好。效价最高可达244ug/ml，比对照170ug/ml提高43%。
5.3培养基中微量元素对雷帕霉素发酵水平的影响。
微量元素是药物产生菌生长繁殖和代谢必需的物质，有文献报道[3]：一些无机盐对菌体的生和产物的积累有促进作用。有的包含在酶或辅酶的组成中，有的能活化各种酶。在特定的情况下，有的需单独加入，Co2+是甲基转移酶的载体，可以激活某些酶。Mn2+对微生物生长有一定的促进作用。本次实验考察了Co2+、Mn2+对雷帕霉素发酵水平的影响。结果如图四、图五所示。Co2+的添加浓度以0.015%为好，Mn2+的添加浓度以0.03%为最好。
6分析与讨论
结果表明，通过对吸水链霉菌的紫外吖啶橙复合诱变，得到了一株高产菌株RP20110722，使效价从65ug/ml提高到143ug/ml，再通过对培养基的优化，最终确定的发酵培养基为（%）：棉子饼粉2，葡萄糖3，甘油0.75，酵母浸出粉0.5，KH2PO4 0.5，硫酸铵0.5，黄豆饼粉0.2，氯化钠0.5，赖氨酸0.5，Co2+0.015%，Mn2+0.03%。使发酵单位提高到262ug/ml，比出发菌株提高了3倍多，取得了明显的效果，为后期的工业化生产奠定了较好的基础。
参考文献
[1]SEHGAL S N，BAKER H，VEZNA C，rapamysin（AY-22，989），a new antifiungal antibiotic II Femententation，isolation，and characterzation[J].，JAntibiot 1975 ，28（10：）726-727
[2]陈希扬等.培养条件优化和菌种选育提高雷帕霉素发酵水平.化学工程 2011年1月第39卷第一期
[3]BALTER M，Protein matchmaker may lead new gene the-rapy to the alter[j].science，1996，273（5272）：183