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【摘要】 目的：研究经红花注射液保存后的人胎羊膜对大鼠皮肤切创愈合过程中基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase-s，MMPS）-2，9表达的影响，探讨其促进切口愈合的机制，为其在临床的应用提供理论依据。方法：建立大鼠皮肤切创模型，观察切口愈合时间、感染率；在各时相点处死取材，应用免疫组织化学技术，通过计算机图像分析系统检测人胎羊膜对不同损伤时间大鼠皮肤组织中MMP-2，MMP-9的表达。结果：创后12 h、1 d、2 d、3 d，红花+羊膜组创缘周围MMP-2，MMP-9表达，较其他三组明显增强（P<0.05）；红花+羊膜组感染率（5%）较其他三组明显减少（P<0.05）。结论：经红花注射液保存后的人胎羊膜在大鼠皮肤切创愈合过程中，可促进创缘周围MMP-2，MMP-9的表达；将其贴附创面能明显减少创口的感染率、促进创口的愈合。
【关键词】 人胎羊膜； 红花注射液； 切创愈合； 基质金属蛋白酶-2； 基质金属蛋白酶-9
近年来，手术切口感染问题及切口的修复过程中细胞因子的研究越来越受重视。基质金属蛋白酶（MMPS）是一组具有相似特征的锌和钙依赖性内肽酶，具有很强的生物学作用，在组织修复、血管形成及组织形态发育、创伤愈合过程中扮演重要角色[1]。人胎羊膜属胎盘，即中药紫河车的一部分，具益气养血之功效。羊膜外用具有防御功能，可阻止细菌入侵；羊膜抗原性非常小，故免疫排斥反应低。现在它已被广泛应用于外科、皮肤科、眼科、泌尿生殖科等[2]。本课题主要研究红花液保存胎膜贴敷创口后对创口感染率及MMP-2，MMP-9表达的影响，为实现对促进切口愈合、减少瘢痕形成的干预和治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 新鲜羊膜的制备 新鲜羊膜取自健康剖宫产产妇的胎盘，选择产前血清学检查排除艾滋病、乙肝、丙肝、梅毒等传染性疾病，无胎膜早破、无胎粪污染的胎盘，钝性剥离羊膜，无菌生理盐水反复漂洗后剪成6 cm×3 cm小块，放入1‰的洗必泰中浸泡消毒10 h备用，使用前再次用无菌生理盐水冲洗。
1.2 红花注射液保存羊膜的制备 将上述处理过的部分羊膜片置入红花注射液（国药准字Z14020783，由山西亚宝药业集团股份有限公司提供）中浸泡12 h后取出，转移到消毒后的中性硅玻璃瓶内，封闭瓶口置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.3 动物模型制备 将80只雄性成年健康清洁级Sprague-Dawley大鼠，（体重300～400 g，由新乡医学院实验动物中心提供）随机分成4组：对照组、羊膜组、红花组、红花+羊膜组；每组20只。每组又设2 d、3 d、5 d、7 d四个时相点，每个时相点5只。5%水合氯醛0.5～0.7 ml/kg腹腔麻醉。消毒铺巾后在背中线旁约1 cm处做长约4 cm纵行切口，深达肌层，止血后间断缝合皮肤及皮下组织。对照组用纱布覆盖切口并包扎；羊膜组、红花+羊膜组将处理过的羊膜（胎儿面）贴敷在切口表面，纱布覆盖并包扎；红花组将红花注射液均匀喷洒、涂抹于切口表面，纱布覆盖后，再次包扎。分笼饲养，3 d后换药，新鲜羊膜组与红花+羊膜组不换羊膜敷料。分别于切创后2、3、5、7 d将大鼠脱颈椎处死。
1.4 方法
1.4.1 免疫组织化染色 取切口处1.5 cm×1.0 cm皮肤组织，取材后均放入4%多聚甲醛中固定12 h后，脱水、透明，石蜡包埋。制作连续切片，切片厚度为5 μm，水浴修复抗原（抗原修复液由北京中杉金桥生物技术有限公司提供），PBS缓冲液清洗5 min×3次，正常羊血清孵育，鼠抗人MMP-2，MMP-9单克隆抗体作为一抗（由北京中杉金桥生物技术有限公司提供）[3]。S-P法免疫组织化学染色（由北京博奥森生物技术有限公司提供）、DAB显色（由北京中杉金桥生物技术有限公司提供）均按说明书进行。苏木素复染，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4.2 结果判定 在光学显微镜（40×10）下每张切片随机取5个测量视野，计数包括中性粒细胞、单核细胞及血管内皮细胞，计算每个视野中阳性细胞数与三种细胞总数的比值。
1.5 切口感染诊断标准 根据国家卫生部医改司医院感染监测小组制定的医院感染诊断标准，本试验以明显红肿或有渗液或有脓性分泌物为切口感染的主要诊断依据[4]。
1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，感染率的比较采用 字2检验；MMP-2，MMP-9阳性细胞比率的数据用（x±s）表示，时间点间两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 切创后创缘MMP-2表达情况 切创后12 h～3 d，对照组与红花组、羊膜组、红花+羊膜组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；红花组与红花+羊膜组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 切创后创缘MMP-9表达情况 切创后12 h～3 d，对照组与红花组、羊膜组、红花+羊膜组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；红花组与红花+羊膜组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 切口感染情况 羊膜组感染率（25%）及红花组感染率（25%）较对照组感染率明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；红花+羊膜组感染率（5%）较对照组、羊膜组及红花组感染率明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
3 讨论
MMP-2，MMP-9是一种功能强大并能产生多种生物学效应的细胞因子，本实验发现，MMP-2，MMP-9于创后12 h～
3 d表达并逐渐增强。
红花为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，临床上常以水煎入药，具有活血通络、散肿止痛之功效[5]。现代研究表明，红花主要含有黄酮醇、苷类、脂肪酸等成分，可抑制血小板聚集、抗血栓形成、促进纤维蛋白溶解、扩张外周血管等[6-7]；同时，其无明显的毒副作用。在临床上广泛应用于心脑血管、血液系统、创伤感染及跌打损伤等疾病[8-9]。本实验表明，红花组的感染率明显低于对照组；切创后12 h～3 d，创口边缘MMP-2，MMP-9表达较对照组明显增强，均有统计学意义；故红花外用可增强MMP-2，MMP-9表达、减少切口感染、促进创伤愈合。 羊膜以其来源广泛，价格低廉，应用操作简便，生物组织相容性好，且存在的伦理问题少等特有的优点和生物学活性，已成为理想的生物材料；但是其取材、保存和使用需遵循严格的医学标准。羊膜组的感染率亦明显低于对照组。然而由于新鲜羊膜存在着安全隐患问题，而且也不能保证随时供应，使其在临床的应用受到很大限制，故临床上大多应用的为保存羊膜作为生物敷料，多种保存羊膜的方法在临床上均有成功的报道[10]。
本实验首次发现了中药红花联合羊膜外用在损伤早期可增强MMP-2，MMP-9表达，同时减少感染率，二者具有协同作用；红花联合羊膜外用贴敷创面，不仅安全，而且价格低廉；经红花注射液保存后的胎羊膜在预防切口感染、促进创面愈合、减少增生性瘢痕方面有一定潜力，两者联合应用更值得进一步研究和探索。
参考文献
[1]文亮，屈纪富，刘明华.基质金属蛋白酶3在创伤愈合中作用的实验研究[J].世界急危重病医学杂志，2007，2（9）：1751-1754.
[2] Armstrong D G， Jude E B. The role of matrix metalloproteinases in wound healing [J]. Am Podiatr Med Assoc，2002，92（17）：12-18.
[3]华彩红，申素芳.羊膜对大鼠皮肤切创愈合中TGF-β表达的影响[J].中国妇幼保健，2011，26（22）：3468-3470.
[4] O’Toole E A. Extracellular matrix and keratinocyte migration [J]. Clin Exp Dermatol， 2001，26（4）：525-530.
[5]刘文忠，恩和吉日嘎拉，康毅敏，等.皮肤创面组织VEGF和MMP-2的表达及意义[J].内蒙古医学院学报，2009，31（19）：85-87.
[6] Deprest J， Jani J， Lewi L， et al. Fetoscopic surgery： Encouraged by clinical experience and boosted by instrument innovation[J]. Semin Fetal Neonatal Med， 2006， 11（25）：398-412.
[7] Ochsenbein-Klble N， Jani J， Lewi L， et al. Enhancing sealing of fetal membrane defects using tissue engineered native amniotic scaffolds in the rabbit model[J]. Am J Obstet Gynecol， 2007， 196（26）：263.e1-263.e7.
[8] Papadopulos N A， Klotz S， Raith A， et al. Amnion cells engineering： a new perspective in fetal membrane healing after intrauterine surgery[J]. Fetal Diagn Ther， 2006， 21（4）：494-500.
[9]郝东明，闻辉，于栋，等.红花注射液保存人胎羊膜移植预防肌腱粘连[J].中医正骨，2005，17（14）：4-5.
[10]朱志军，徐国士，赵静，等.牛羊膜在烧伤创面的临床应用研究[J].中国修复重建外科杂志，2006，20（9）：735-738.
（收稿日期：2013-03-26） （本文编辑：郎威）
【关键词】 人胎羊膜； 红花注射液； 切创愈合； 基质金属蛋白酶-2； 基质金属蛋白酶-9
近年来，手术切口感染问题及切口的修复过程中细胞因子的研究越来越受重视。基质金属蛋白酶（MMPS）是一组具有相似特征的锌和钙依赖性内肽酶，具有很强的生物学作用，在组织修复、血管形成及组织形态发育、创伤愈合过程中扮演重要角色[1]。人胎羊膜属胎盘，即中药紫河车的一部分，具益气养血之功效。羊膜外用具有防御功能，可阻止细菌入侵；羊膜抗原性非常小，故免疫排斥反应低。现在它已被广泛应用于外科、皮肤科、眼科、泌尿生殖科等[2]。本课题主要研究红花液保存胎膜贴敷创口后对创口感染率及MMP-2，MMP-9表达的影响，为实现对促进切口愈合、减少瘢痕形成的干预和治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 新鲜羊膜的制备 新鲜羊膜取自健康剖宫产产妇的胎盘，选择产前血清学检查排除艾滋病、乙肝、丙肝、梅毒等传染性疾病，无胎膜早破、无胎粪污染的胎盘，钝性剥离羊膜，无菌生理盐水反复漂洗后剪成6 cm×3 cm小块，放入1‰的洗必泰中浸泡消毒10 h备用，使用前再次用无菌生理盐水冲洗。
1.2 红花注射液保存羊膜的制备 将上述处理过的部分羊膜片置入红花注射液（国药准字Z14020783，由山西亚宝药业集团股份有限公司提供）中浸泡12 h后取出，转移到消毒后的中性硅玻璃瓶内，封闭瓶口置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.3 动物模型制备 将80只雄性成年健康清洁级Sprague-Dawley大鼠，（体重300～400 g，由新乡医学院实验动物中心提供）随机分成4组：对照组、羊膜组、红花组、红花+羊膜组；每组20只。每组又设2 d、3 d、5 d、7 d四个时相点，每个时相点5只。5%水合氯醛0.5～0.7 ml/kg腹腔麻醉。消毒铺巾后在背中线旁约1 cm处做长约4 cm纵行切口，深达肌层，止血后间断缝合皮肤及皮下组织。对照组用纱布覆盖切口并包扎；羊膜组、红花+羊膜组将处理过的羊膜（胎儿面）贴敷在切口表面，纱布覆盖并包扎；红花组将红花注射液均匀喷洒、涂抹于切口表面，纱布覆盖后，再次包扎。分笼饲养，3 d后换药，新鲜羊膜组与红花+羊膜组不换羊膜敷料。分别于切创后2、3、5、7 d将大鼠脱颈椎处死。
1.4 方法
1.4.1 免疫组织化染色 取切口处1.5 cm×1.0 cm皮肤组织，取材后均放入4%多聚甲醛中固定12 h后，脱水、透明，石蜡包埋。制作连续切片，切片厚度为5 μm，水浴修复抗原（抗原修复液由北京中杉金桥生物技术有限公司提供），PBS缓冲液清洗5 min×3次，正常羊血清孵育，鼠抗人MMP-2，MMP-9单克隆抗体作为一抗（由北京中杉金桥生物技术有限公司提供）[3]。S-P法免疫组织化学染色（由北京博奥森生物技术有限公司提供）、DAB显色（由北京中杉金桥生物技术有限公司提供）均按说明书进行。苏木素复染，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4.2 结果判定 在光学显微镜（40×10）下每张切片随机取5个测量视野，计数包括中性粒细胞、单核细胞及血管内皮细胞，计算每个视野中阳性细胞数与三种细胞总数的比值。
1.5 切口感染诊断标准 根据国家卫生部医改司医院感染监测小组制定的医院感染诊断标准，本试验以明显红肿或有渗液或有脓性分泌物为切口感染的主要诊断依据[4]。
1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，感染率的比较采用 字2检验；MMP-2，MMP-9阳性细胞比率的数据用（x±s）表示，时间点间两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 切创后创缘MMP-2表达情况 切创后12 h～3 d，对照组与红花组、羊膜组、红花+羊膜组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；红花组与红花+羊膜组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 切创后创缘MMP-9表达情况 切创后12 h～3 d，对照组与红花组、羊膜组、红花+羊膜组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；红花组与红花+羊膜组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 切口感染情况 羊膜组感染率（25%）及红花组感染率（25%）较对照组感染率明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；红花+羊膜组感染率（5%）较对照组、羊膜组及红花组感染率明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
3 讨论
MMP-2，MMP-9是一种功能强大并能产生多种生物学效应的细胞因子，本实验发现，MMP-2，MMP-9于创后12 h～
3 d表达并逐渐增强。
红花为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，临床上常以水煎入药，具有活血通络、散肿止痛之功效[5]。现代研究表明，红花主要含有黄酮醇、苷类、脂肪酸等成分，可抑制血小板聚集、抗血栓形成、促进纤维蛋白溶解、扩张外周血管等[6-7]；同时，其无明显的毒副作用。在临床上广泛应用于心脑血管、血液系统、创伤感染及跌打损伤等疾病[8-9]。本实验表明，红花组的感染率明显低于对照组；切创后12 h～3 d，创口边缘MMP-2，MMP-9表达较对照组明显增强，均有统计学意义；故红花外用可增强MMP-2，MMP-9表达、减少切口感染、促进创伤愈合。 羊膜以其来源广泛，价格低廉，应用操作简便，生物组织相容性好，且存在的伦理问题少等特有的优点和生物学活性，已成为理想的生物材料；但是其取材、保存和使用需遵循严格的医学标准。羊膜组的感染率亦明显低于对照组。然而由于新鲜羊膜存在着安全隐患问题，而且也不能保证随时供应，使其在临床的应用受到很大限制，故临床上大多应用的为保存羊膜作为生物敷料，多种保存羊膜的方法在临床上均有成功的报道[10]。
本实验首次发现了中药红花联合羊膜外用在损伤早期可增强MMP-2，MMP-9表达，同时减少感染率，二者具有协同作用；红花联合羊膜外用贴敷创面，不仅安全，而且价格低廉；经红花注射液保存后的胎羊膜在预防切口感染、促进创面愈合、减少增生性瘢痕方面有一定潜力，两者联合应用更值得进一步研究和探索。
参考文献
[1]文亮，屈纪富，刘明华.基质金属蛋白酶3在创伤愈合中作用的实验研究[J].世界急危重病医学杂志，2007，2（9）：1751-1754.
[2] Armstrong D G， Jude E B. The role of matrix metalloproteinases in wound healing [J]. Am Podiatr Med Assoc，2002，92（17）：12-18.
[3]华彩红，申素芳.羊膜对大鼠皮肤切创愈合中TGF-β表达的影响[J].中国妇幼保健，2011，26（22）：3468-3470.
[4] O’Toole E A. Extracellular matrix and keratinocyte migration [J]. Clin Exp Dermatol， 2001，26（4）：525-530.
[5]刘文忠，恩和吉日嘎拉，康毅敏，等.皮肤创面组织VEGF和MMP-2的表达及意义[J].内蒙古医学院学报，2009，31（19）：85-87.
[6] Deprest J， Jani J， Lewi L， et al. Fetoscopic surgery： Encouraged by clinical experience and boosted by instrument innovation[J]. Semin Fetal Neonatal Med， 2006， 11（25）：398-412.
[7] Ochsenbein-Klble N， Jani J， Lewi L， et al. Enhancing sealing of fetal membrane defects using tissue engineered native amniotic scaffolds in the rabbit model[J]. Am J Obstet Gynecol， 2007， 196（26）：263.e1-263.e7.
[8] Papadopulos N A， Klotz S， Raith A， et al. Amnion cells engineering： a new perspective in fetal membrane healing after intrauterine surgery[J]. Fetal Diagn Ther， 2006， 21（4）：494-500.
[9]郝东明，闻辉，于栋，等.红花注射液保存人胎羊膜移植预防肌腱粘连[J].中医正骨，2005，17（14）：4-5.
[10]朱志军，徐国士，赵静，等.牛羊膜在烧伤创面的临床应用研究[J].中国修复重建外科杂志，2006，20（9）：735-738.
（收稿日期：2013-03-26） （本文编辑：郎威）