论文部分内容阅读
摘要 [目的]研究毕赤酵母菌株（Pichia GS115）表达人C型溶菌酶（HLYZ）的发酵与分离纯化的工艺。[方法]探讨酵母生长规律，研究不同菌体浓度、不同诱导时间对蛋白产量的影响，并且探讨不同pH条件对DEAESepharose FF和CMSepharose FF层析分离纯化目标蛋白的影响。[结果] 毕赤酵母菌株表达HLYZ的最佳发酵条件为：发酵24 h用浓度1%甲醇诱导，以后每12 h用浓度1%甲醇诱导，共6次，在此条件下可获得高产量目标蛋白。DEAESepharose FF和CMSepharose FF分离纯化目标蛋白的最佳pH 分别为6.65和6.50。[结论]该研究可为人C型溶菌酶的工艺化生产提供理论指导。
关键词 人C型溶菌酶；毕赤酵母；发酵；DEAE与CM层析
中图分类号 S188+.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）31-10836-03
Study of the Human Ctype Lysozyme Fermentation， Separation and Purification
WANG Lintao1， YAO Di2
（1. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200433； 2. Changzhou Technican College， Changzhou， Jiangsu 213017）
Abstract [Objective] To study the fermentation， separation and purification of human ctype lysozyme from Pichia yeast strain （Pichia GS115）. [Method] The effections of different cell concentration and different induction time on the protein production were investigated. The effection of the pH conditions on the DEAESepharose FF and CMSepharose FF chromatography separation and purification of the target protein were also investigated. [Result] It was found that optimal fermentation conditions for human ctype lysozyme were as follows： induction with 1% methanol after 24 h fermentation， next， induction with 1% methanol every 12 h， six times. Under the above conditions， high yield of the target proteins were obtained. The optimal pH conditions for the DEAESepharose FF and CMSepharose FF separation and purification are 6.65 and 6.5. [Conclusion] The research provides theoretical guidance for the industrial production of human ctype lysozyme from Pichia yeast strain （Pichia GS115）.
Key words Human ctype lysozyme； Pichia yeast； Fermentation； DEAESepharose FF and CMSepharose FF
C型人溶菌酶（HLYZ）由英國著名科学家弗莱明[1]发现，是一种1，4βN溶菌酶。它切割细菌细胞壁肽聚糖N乙酰胞壁酸（MurNAc）和N乙酰葡萄糖胺（GlcNAcC4）之间的糖苷键，破坏肽聚糖骨架，在细菌内部渗透压作用下导致细菌破裂达到杀菌效果[2]。HLYZ广泛存在于人体的体液、细胞及组织器官中[3]，可见其对人体的重要性。HLYZ有着独特的优越性和非常多的药理作用，具有多重临床应用价值[4-8]。鉴于其重要的生理作用，目前国外对HLYZ的制备过程进行了广泛的研究与开发，所采用的HLYZ表达的宿主菌大多为毕赤酵母GS115菌株，以pPIC9K为载体，可以获得对HLYZ的高表达[9]。
国内采用毕赤酵母发酵生产HLYZ的报道较少，有利用大肠杆茵、酵母茵和真茵表达系统表达HLYZ，最高水平为40 mg/L[10]。笔者采用毕赤酵母GS115菌株表达HLYZ，分别研究不同菌体浓度、不同诱导时间对蛋白产量的影响，得出可获得高产量HLYZ的发酵条件。近年来，有利用离子交换层析分离纯化人溶菌酶研究的报道[11-12]。笔者在不同pH条件下对HLYZ进行DEAESepharose FF及CMSepharose FF层析分离纯化研究。在SDSPAGE电泳检测结果，清晰可见单一目标蛋白条带，分离纯化效果非常好。该研究为实现HLYZ规模化生产提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株。含pPIC9K/HLYZ载体的毕赤酵母菌GS115HLYZ重组菌株，由研究室构建和保存；HLYZ活性测定用溶壁微球菌AS 1.634，购自中国科学院微生物研究所。
关键词 人C型溶菌酶；毕赤酵母；发酵；DEAE与CM层析
中图分类号 S188+.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）31-10836-03
Study of the Human Ctype Lysozyme Fermentation， Separation and Purification
WANG Lintao1， YAO Di2
（1. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200433； 2. Changzhou Technican College， Changzhou， Jiangsu 213017）
Abstract [Objective] To study the fermentation， separation and purification of human ctype lysozyme from Pichia yeast strain （Pichia GS115）. [Method] The effections of different cell concentration and different induction time on the protein production were investigated. The effection of the pH conditions on the DEAESepharose FF and CMSepharose FF chromatography separation and purification of the target protein were also investigated. [Result] It was found that optimal fermentation conditions for human ctype lysozyme were as follows： induction with 1% methanol after 24 h fermentation， next， induction with 1% methanol every 12 h， six times. Under the above conditions， high yield of the target proteins were obtained. The optimal pH conditions for the DEAESepharose FF and CMSepharose FF separation and purification are 6.65 and 6.5. [Conclusion] The research provides theoretical guidance for the industrial production of human ctype lysozyme from Pichia yeast strain （Pichia GS115）.
Key words Human ctype lysozyme； Pichia yeast； Fermentation； DEAESepharose FF and CMSepharose FF
C型人溶菌酶（HLYZ）由英國著名科学家弗莱明[1]发现，是一种1，4βN溶菌酶。它切割细菌细胞壁肽聚糖N乙酰胞壁酸（MurNAc）和N乙酰葡萄糖胺（GlcNAcC4）之间的糖苷键，破坏肽聚糖骨架，在细菌内部渗透压作用下导致细菌破裂达到杀菌效果[2]。HLYZ广泛存在于人体的体液、细胞及组织器官中[3]，可见其对人体的重要性。HLYZ有着独特的优越性和非常多的药理作用，具有多重临床应用价值[4-8]。鉴于其重要的生理作用，目前国外对HLYZ的制备过程进行了广泛的研究与开发，所采用的HLYZ表达的宿主菌大多为毕赤酵母GS115菌株，以pPIC9K为载体，可以获得对HLYZ的高表达[9]。
国内采用毕赤酵母发酵生产HLYZ的报道较少，有利用大肠杆茵、酵母茵和真茵表达系统表达HLYZ，最高水平为40 mg/L[10]。笔者采用毕赤酵母GS115菌株表达HLYZ，分别研究不同菌体浓度、不同诱导时间对蛋白产量的影响，得出可获得高产量HLYZ的发酵条件。近年来，有利用离子交换层析分离纯化人溶菌酶研究的报道[11-12]。笔者在不同pH条件下对HLYZ进行DEAESepharose FF及CMSepharose FF层析分离纯化研究。在SDSPAGE电泳检测结果，清晰可见单一目标蛋白条带，分离纯化效果非常好。该研究为实现HLYZ规模化生产提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株。含pPIC9K/HLYZ载体的毕赤酵母菌GS115HLYZ重组菌株，由研究室构建和保存；HLYZ活性测定用溶壁微球菌AS 1.634，购自中国科学院微生物研究所。