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【摘要】 目的 以灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷为例，探讨不同配伍比例和剂量联合用药对机体免疫功能的不同影响。方法 以SPF级昆明种小鼠为实验对象，以灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷按A配方2：2：1.5和B配方10：10：1.5组合，每种配方分为低、中、高三个剂量组，同時设置溶剂对照组，连续灌胃给予受试物1个月，然后进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞活性测定实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和血清溶血素的测定实验。结果 与溶剂对照组比较，A配方只有低剂量组能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力和血清溶血素抗体积数显著提高；B配方低剂量组显著提高了ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力和NK细胞活性，低、中、高剂量组均能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力和血清溶血素抗体积数显著提高，但高剂量组却显著抑制了ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力和NK细胞活性。结论 B配方能够增强机体免疫力，但高剂量会抑制免疫功能。
【关键词】 灵芝多糖；红景天苷；西洋参皂苷；免疫功能
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.09.610 文章编号：1004-7484（2013）-09-5285-02
随着现代医学的发展，人们逐渐认识到许多疾病的发生、人体衰老及老年人多发病均与免疫系统的紊乱有密切关系。对机体免疫力有促进作用的功能性食品、药品的研究开发，日益受到人们的关注[1]。已有文献报导多种中药组方具有调节机体免疫力的作用[2-4]，市面上也逐渐出现了越来越多的提高机体免疫力的复方制剂，但各组份之间以何种比例配伍为优还未见报导。另外组方中各组份发挥增强免疫功能时使用剂量范围不一致，以灵芝多糖为例，有文献报导10mg/kg和2000mg/kg的灵芝多糖均具有增强免疫力的功能，但也有文献报导大剂量（10mg/kg）灵芝多糖对免疫功能具有抑制作用，而适当剂量（0.05mg/kg）灵芝多糖对免疫功能具有增强作用。然而，目前对药物配伍比例与剂量尚无系统研究，本研究旨在探讨不同配伍比例和剂量联合用药对机体免疫功能的不同影响。
许多研究发现，多种中药组份具有良好的免疫调节作用，灵芝、红景天、西洋参是传统医学中的名贵药材，灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷是这三种名贵药材的有效成份，药理研究表明，这三种有效成份都具有提高机体免疫力的作用。本研究选取灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷为受试物，就中药组方的配伍比例和剂量问题，按照卫生部颁布的《保健食品检验与评价技术规范》有关增强免疫力功能的要求，初步探讨不同配伍比例和剂量联合用药对机体免疫功能的不同影响。
1 资料与方法
1.1 药物与试剂 灵芝多糖购自浙江五养堂药业有限公司；红景天苷购自陕西森弗生物技术有限公司；西洋参皂苷购自惠州市神农本草保健制品有限公司；小牛血清购自Hyclone公司；RPMI-1640细胞培养基购自Gibco公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）和刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）购自Sigma公司；绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）购自广州蕊特生物科技有限公司；鸡红细胞（chicken red blood cell，CRBC），抽取静脉血，按常规法制备；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 实验动物及环境 SPF级昆明种雌性小鼠210只，体重范围为18-22g，由湖北省实验动物研究中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2008-0005。动物饲养温度为20-25℃，湿度为40%-70%，实验前适应环境3天。
1.3 受试物和动物分组 受试物分为两种不同比例的配方，即A配方和B配方，其中A配方以灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷按2：2：1.5组合，B配方以灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷按10：10：1.5组合，每种配方分别设置低、中、高三个剂量组，见表1。
1.4 实验方法
1.4.1 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验 采用MTT法测定小鼠淋巴细胞转化能力，具体实验方法参照《保健食品检验与评价技术规范》，在酶标仪570nm波长处测定吸光度（OD）值，以加ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值代表淋巴细胞的增殖能力。受试样品组的吸光度值显著高于对照组，可判定该项实验结果为阳性。
1.4.2 NK细胞活性测定实验 采用乳酸脱氢酶（LDH）测定法。具体实验方法参照《保健食品检验与评价技术规范》，按以下公式计算NK细胞活性：
NK细胞活性（%）= 反应孔OD-自然释放孔OD最大释放孔OD-自然释放孔OD×100
受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组，可判定该项实验结果为阳性。
1.4.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 采用半体内法。具体实验方法参照《保健食品检验与评价技术规范》，按下式计算吞噬率和吞噬指数：
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数计数的巨噬细胞数
受试样品组的吞噬指数显著高于对照组吞噬指数或吞噬百分率，可判定该项实验结果为阳性。
1.4.4 小鼠血清溶血素的测定实验 采用血凝法。具体实验方法参照《保健食品检验与评价技术规范》。受试样品组的抗体积数显著高于对照组，可判定该项实验结果为阳性。
1.5 统计方法 所有结果以mean±SE表示，采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），比较各实验组与对照组的差异，以P<0.05被认为有显著性差异。
2 结果 2.1 受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力的影响 从表2可见，与溶剂对照组比较，A配方低、中、高剂量组均对ConA诱导的小鼠淋巴细胞的增殖能力无显著影响（P>0.05）；B配方低剂量组能显著增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞的增殖能力（P<0.01），中剂量组对ConA诱导的小鼠淋巴细胞的增殖能力无显著影响（P>0.05），而高剂量组却显著抑制了ConA诱导的小鼠淋巴细胞的增殖能力（P<0.05）。
3 讨论
免疫系统是机体保护自身的防御性结构，免疫是人体对各种疾病的抵抗能力，机体的免疫系统是由非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫共同构成的防御系统。淋巴细胞能识别、杀伤和排斥外来异己分子及癌变细胞，增强机体对疾病的抵抗能力，当T淋巴细胞受到ConA刺激后能转化、增殖为淋巴母细胞，其转化率可反应机体的细胞免疫功能；NK细胞被认为是机体天然免疫的第一道防线，起到連接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁作用；巨噬细胞是机体免疫系统中重要的细胞成分之一，体内腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要指标之一；血清溶血素可以反应机体内抗体形成细胞所分泌的抗体水平，反映了机体的体液免疫功能。
灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷单独使用时都具有增强免疫力的功能，本研究选取这三种名贵中草药的有效成份，以A、B两种配方组合，通过ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞活性测定实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和血清溶血素的测定实验，观察A、B两种配方对小鼠免疫功能的影响，以探讨不同配伍比例和剂量联合用药对机体免疫功能的不同影响。
结果显示，与溶剂对照组比较，A配方只有低剂量组能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力和血清溶血素抗体积数显著提高；B配方低剂量组显著提高了ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力和NK细胞活性，低、中、高剂量组均能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力和血清溶血素抗体积数显著升高。根据《保健食品检验与评价技术规范》中增强免疫力实验结果判定标准：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。根据以上免疫功能判定标准，结合本研究中四个实验结果得出以下结论：A配方可能不具有增强免疫力的功能，B配方能够增强免疫力，说明如果配伍不合理，名贵药材的组合可能不能起到增强免疫力的功能。
但值得引起重视的是，B配方高剂量组显著抑制了ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力和NK细胞活性，说明B配方虽具有增强免疫力的功能，但高剂量时显著抑制细胞免疫功能。而细胞免疫是机体的重要防御因素，机体细胞免疫功能状态，尤其是机体的抗肿瘤免疫水平在肿瘤的发生及发展过程中发挥着及其重要的作用。细胞免疫低下机体的免疫功能被抑制或紊乱，使肿瘤细胞能够逃避机体免疫系统对其的杀伤作用，有利于肿瘤的发生和发展。对于本研究中B配方虽具有增强免疫力的功能，但高剂量时显著抑制细胞免疫功能，细胞免疫低下与肿瘤发生的关系有待进一步研究。
参考文献
[1] 蔡文娣，初金鑫，付辰炜，等.壳寡糖对正常小鼠免疫功能的影响[J].中国海洋药物杂志，2010，29（4）：42-45.
[2] 董淳，徐群英.芪附汤及其组方对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].中国中医药信息杂志，2001，8（9）：39-41.
[3] 萧闵，杨阳，刘洋洋.番茄红素与枸杞协同增强小鼠免疫力的实验研究[J].湖北中医杂志，2010，32（7）：8-9.
[4] 李佳，程井军，刘洋洋.原花青素与熟地对小鼠免疫功能的影响[J].中国民族民间医药，2010：26-27.
[5] 沈新娥，龚珊，蒋星红，等.复方虫草精华对小鼠免疫功能的影响[J].中国血液流变学杂志，2003，13（4）：327-330.
[6] 王玉娥，田洁，樊柏林，等.黄芪虫草复方制剂对小鼠抗疲劳和增强免疫功能的实验研究[J].公共卫生与预防医学，2010，21（3）：81-82.
[7] 李金花，于文斌，赵丽茹，等.红景天灵芝胶囊增强免疫力及抗辐射功能研究[J].长春中医药大学学报，2010，26（6）：817-818.
【关键词】 灵芝多糖；红景天苷；西洋参皂苷；免疫功能
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.09.610 文章编号：1004-7484（2013）-09-5285-02
随着现代医学的发展，人们逐渐认识到许多疾病的发生、人体衰老及老年人多发病均与免疫系统的紊乱有密切关系。对机体免疫力有促进作用的功能性食品、药品的研究开发，日益受到人们的关注[1]。已有文献报导多种中药组方具有调节机体免疫力的作用[2-4]，市面上也逐渐出现了越来越多的提高机体免疫力的复方制剂，但各组份之间以何种比例配伍为优还未见报导。另外组方中各组份发挥增强免疫功能时使用剂量范围不一致，以灵芝多糖为例，有文献报导10mg/kg和2000mg/kg的灵芝多糖均具有增强免疫力的功能，但也有文献报导大剂量（10mg/kg）灵芝多糖对免疫功能具有抑制作用，而适当剂量（0.05mg/kg）灵芝多糖对免疫功能具有增强作用。然而，目前对药物配伍比例与剂量尚无系统研究，本研究旨在探讨不同配伍比例和剂量联合用药对机体免疫功能的不同影响。
许多研究发现，多种中药组份具有良好的免疫调节作用，灵芝、红景天、西洋参是传统医学中的名贵药材，灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷是这三种名贵药材的有效成份，药理研究表明，这三种有效成份都具有提高机体免疫力的作用。本研究选取灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷为受试物，就中药组方的配伍比例和剂量问题，按照卫生部颁布的《保健食品检验与评价技术规范》有关增强免疫力功能的要求，初步探讨不同配伍比例和剂量联合用药对机体免疫功能的不同影响。
1 资料与方法
1.1 药物与试剂 灵芝多糖购自浙江五养堂药业有限公司；红景天苷购自陕西森弗生物技术有限公司；西洋参皂苷购自惠州市神农本草保健制品有限公司；小牛血清购自Hyclone公司；RPMI-1640细胞培养基购自Gibco公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）和刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）购自Sigma公司；绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）购自广州蕊特生物科技有限公司；鸡红细胞（chicken red blood cell，CRBC），抽取静脉血，按常规法制备；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 实验动物及环境 SPF级昆明种雌性小鼠210只，体重范围为18-22g，由湖北省实验动物研究中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2008-0005。动物饲养温度为20-25℃，湿度为40%-70%，实验前适应环境3天。
1.3 受试物和动物分组 受试物分为两种不同比例的配方，即A配方和B配方，其中A配方以灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷按2：2：1.5组合，B配方以灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷按10：10：1.5组合，每种配方分别设置低、中、高三个剂量组，见表1。
1.4 实验方法
1.4.1 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验 采用MTT法测定小鼠淋巴细胞转化能力，具体实验方法参照《保健食品检验与评价技术规范》，在酶标仪570nm波长处测定吸光度（OD）值，以加ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值代表淋巴细胞的增殖能力。受试样品组的吸光度值显著高于对照组，可判定该项实验结果为阳性。
1.4.2 NK细胞活性测定实验 采用乳酸脱氢酶（LDH）测定法。具体实验方法参照《保健食品检验与评价技术规范》，按以下公式计算NK细胞活性：
NK细胞活性（%）= 反应孔OD-自然释放孔OD最大释放孔OD-自然释放孔OD×100
受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组，可判定该项实验结果为阳性。
1.4.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 采用半体内法。具体实验方法参照《保健食品检验与评价技术规范》，按下式计算吞噬率和吞噬指数：
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数计数的巨噬细胞数
受试样品组的吞噬指数显著高于对照组吞噬指数或吞噬百分率，可判定该项实验结果为阳性。
1.4.4 小鼠血清溶血素的测定实验 采用血凝法。具体实验方法参照《保健食品检验与评价技术规范》。受试样品组的抗体积数显著高于对照组，可判定该项实验结果为阳性。
1.5 统计方法 所有结果以mean±SE表示，采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），比较各实验组与对照组的差异，以P<0.05被认为有显著性差异。
2 结果 2.1 受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力的影响 从表2可见，与溶剂对照组比较，A配方低、中、高剂量组均对ConA诱导的小鼠淋巴细胞的增殖能力无显著影响（P>0.05）；B配方低剂量组能显著增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞的增殖能力（P<0.01），中剂量组对ConA诱导的小鼠淋巴细胞的增殖能力无显著影响（P>0.05），而高剂量组却显著抑制了ConA诱导的小鼠淋巴细胞的增殖能力（P<0.05）。
3 讨论
免疫系统是机体保护自身的防御性结构，免疫是人体对各种疾病的抵抗能力，机体的免疫系统是由非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫共同构成的防御系统。淋巴细胞能识别、杀伤和排斥外来异己分子及癌变细胞，增强机体对疾病的抵抗能力，当T淋巴细胞受到ConA刺激后能转化、增殖为淋巴母细胞，其转化率可反应机体的细胞免疫功能；NK细胞被认为是机体天然免疫的第一道防线，起到連接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁作用；巨噬细胞是机体免疫系统中重要的细胞成分之一，体内腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要指标之一；血清溶血素可以反应机体内抗体形成细胞所分泌的抗体水平，反映了机体的体液免疫功能。
灵芝多糖、红景天苷和西洋参皂苷单独使用时都具有增强免疫力的功能，本研究选取这三种名贵中草药的有效成份，以A、B两种配方组合，通过ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞活性测定实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和血清溶血素的测定实验，观察A、B两种配方对小鼠免疫功能的影响，以探讨不同配伍比例和剂量联合用药对机体免疫功能的不同影响。
结果显示，与溶剂对照组比较，A配方只有低剂量组能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力和血清溶血素抗体积数显著提高；B配方低剂量组显著提高了ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力和NK细胞活性，低、中、高剂量组均能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力和血清溶血素抗体积数显著升高。根据《保健食品检验与评价技术规范》中增强免疫力实验结果判定标准：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。根据以上免疫功能判定标准，结合本研究中四个实验结果得出以下结论：A配方可能不具有增强免疫力的功能，B配方能够增强免疫力，说明如果配伍不合理，名贵药材的组合可能不能起到增强免疫力的功能。
但值得引起重视的是，B配方高剂量组显著抑制了ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力和NK细胞活性，说明B配方虽具有增强免疫力的功能，但高剂量时显著抑制细胞免疫功能。而细胞免疫是机体的重要防御因素，机体细胞免疫功能状态，尤其是机体的抗肿瘤免疫水平在肿瘤的发生及发展过程中发挥着及其重要的作用。细胞免疫低下机体的免疫功能被抑制或紊乱，使肿瘤细胞能够逃避机体免疫系统对其的杀伤作用，有利于肿瘤的发生和发展。对于本研究中B配方虽具有增强免疫力的功能，但高剂量时显著抑制细胞免疫功能，细胞免疫低下与肿瘤发生的关系有待进一步研究。
参考文献
[1] 蔡文娣，初金鑫，付辰炜，等.壳寡糖对正常小鼠免疫功能的影响[J].中国海洋药物杂志，2010，29（4）：42-45.
[2] 董淳，徐群英.芪附汤及其组方对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].中国中医药信息杂志，2001，8（9）：39-41.
[3] 萧闵，杨阳，刘洋洋.番茄红素与枸杞协同增强小鼠免疫力的实验研究[J].湖北中医杂志，2010，32（7）：8-9.
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[5] 沈新娥，龚珊，蒋星红，等.复方虫草精华对小鼠免疫功能的影响[J].中国血液流变学杂志，2003，13（4）：327-330.
[6] 王玉娥，田洁，樊柏林，等.黄芪虫草复方制剂对小鼠抗疲劳和增强免疫功能的实验研究[J].公共卫生与预防医学，2010，21（3）：81-82.
[7] 李金花，于文斌，赵丽茹，等.红景天灵芝胶囊增强免疫力及抗辐射功能研究[J].长春中医药大学学报，2010，26（6）：817-818.