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[摘要]目的 建立中山地区常住人口CD4+T淋巴细胞计数生物参考区间。 方法 选取140例中山地区健康个体，分为15～19岁、20～29岁、30～39岁、40～49岁和50～59岁共5个年龄组。以Partec PAS流式细胞仪测定外周血CD4+T淋巴细胞绝对数。 结果 同性别各年龄层之间以及不同性别之间的CD4+T细胞数差异均无统计学意义（P>0.05 ）；合并各组个体结果，数据呈正态分布，以（x±1.96s）确定95%的参考区间为（804.7±387.3）个/?L。 结论 成功建立本地区健康成人外周血CD4+T细胞计数的参考范围，为本地区艾滋病患者的临床分期诊断、抗病毒治疗效果提供参考依据。
[关键词] CD4+T淋巴细胞计数；参考区间；流式细胞术；艾滋病
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）16-18-02
CD4+T淋巴细胞是免疫反应的中心细胞，并为HIV感染的主要靶细胞。人体感染了HIV后，可导致CD4+T淋巴细胞数量的不断减少，从而继发免疫缺陷。CD4+T淋巴细胞计数可以评价HIV感染者免疫状况、预测判断疾病进程、评价抗病毒治疗效果和估测预后，为HIV感染患者免疫系统损害状况最明确的指标。目前，我国尚未建立Partec PAS流式细胞仪计数CD4+T淋巴细胞的生物参考区间，中山地区亦未建立本地区人群的CD4+T淋巴细胞计数生物参考区间。本研究使用Partec PAS流式细胞仪测定了140例中山地区健康成人外周血的CD4+T淋巴细胞数，以确定本地区健康成人外周血CD4+T淋巴细胞的生物参考区间。
1 对象与方法
1.1 研究对象
本研究采用配额抽样的方法，选取140名15～59岁的本地区健康个体，分为5组：15～19岁年龄组，男9名，女8名；
20～29岁年龄组，男17名，女18名；30～39岁年龄组，男20名，女20名；40～49岁年龄组，男15名，女15名；50～59岁年龄组，男9名，女9名。纳入对象需经常规体检无异常，实验室检测HBV表面抗原以及HCV、HIV和梅毒抗体均阴性，谷丙转氨酶和血细胞常规计数均正常。
1.2 检测仪器及试剂
德国Partec公司的PAS型流式细胞仪和配套的CD4+T细胞快速计数试剂、校准标准微球、样品管及鞘液，质控品为BECKMAN IMMUNO-TROLTM Cells。
1.3 标本的采集和检测
采集静脉血2～3mL，置于含K3-EDTA抗凝剂真空采血管；用标准微球对仪器进行校准，然后在样品管中加入20?L抗凝全血，再加入 20?L PE 标记的 CD4 分子抗体，混匀并于室温避光放置10～15min使之充分反应，最后加入 800?L 免洗缓冲液并轻轻混匀上机；质控品与样品同样处理和测定。处理后的样品检测在6h内完成。
1.4 统计学处理
用 SPSS 13.0软件进行统计分析，P<0.05为差异有统
计学意义。各组数据皆呈正态分布且具方差齐性，因此各年龄组间的CD4+T淋巴细胞计数结果均值比较采用方差分析，而相同年龄组男性和女性之间的CD4+T细胞均值比较采用两独立样本t检验，以x±1.96s确定参考区间。
2 结果
2.1 离群值的剔除
根据CLSI C28-A3 文件[1]，各组数据按大小顺序排列后，将疑似离群值与其相邻值的差值（D）和数据全距（R）相除，若D/R>1/3则考虑为离群值。根据该文件规则，男性20～29岁年龄组一数据为离群值而被剔除。
2.2 中山地区健康成人的CD4+T淋巴细胞计数结果
用（）来表示各年龄组不同性别的CD4+T淋巴细胞数，结果见表 1。同性别各年龄组之间以及同年龄组男女之间的CD4+T淋巴细胞计数结果均值的差异均无统计学意义（P均>0.05）；将同性别各年龄组计数结果数据合并后，男性的CD4+T淋巴细胞数为（817.0±182.6）个/?L，女性的CD4+T淋巴细胞数为（792.6±211.9）个/?L；经两独立样本t检验，男性和女性之间的CD4+T淋巴细胞均值差异无统计学意义（t=0.732， P=0.465）。
2.3 中山地区健康成人的外周血CD4+ T淋巴细胞数参考区间
由于所分各组的CD4+T淋巴细胞数均值差异均无统计学意义，因此合并本研究获得的全部个体的CD4+T淋巴细胞计数结果。合并数据呈正态分布，故以（x±1.96s）确定其95%的分布范围，结果为（804.7±387.3）个/?L。
3 讨论
淋巴细胞亚群能反映机体的免疫状况、判断药物疗效，并且还可以预示疾病进展的快慢，因而在感染性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病的研究中越来越受到重视。美国疾病预防控制中心测定成人外周血CD4+T淋巴细胞数的参考范围为（844±247）个/?L，并规定CD4+T淋巴细胞绝对数≤500个/?L作为AIDS诊断依据之一，以此作为HIV感染后需要开始进行抗病毒治疗的实验室指标[2]。然而，外周血中淋巴细胞含量受生活环境、社会经济、种族特点的影响，不同地域及不同种族的正常参考值不尽相同，不同仪器和试剂获得的结果也存在一定的偏差。因此，《全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）》要求各地应建立本地区的包括CD4+T淋巴细胞绝对计数的正常参考范围 [3]。
本研究结果显示，中山地区健康成人外周血CD4+T淋巴细胞的参考范围为（804.7±387.3）个/?L。其变异范围与陈铁龙等[4-5]的研究结果类似，但明显大于美国和国内大都数实验室建立的CD4+T淋巴细胞参考范围[6-10]。这可能与使用的仪器、试剂等的不同有关。另外，本研究结果表明，不同性别和年龄的健康成人外周血CD4+T淋巴细胞之间没有差异，这与已有的大部分研究结果相一致[6-9]。 本研究建立的中山地区健康成人外周血的CD4+T淋巴细胞计数参考范围，可以为本地区艾滋病患者的临床分期诊断、抗病毒治疗效果提供参考依据。由于儿童外周血CD4+T细胞的参考范围与成人不同[3]，我们下一步工作将建立本地区不同年龄段儿童的外周血CD4+T细胞计数的参考范围。
[参考文献]
[1] CLSI C28-A3. Defining，establishing，and verifying reference intervals in the clinical laboratory； approved guideline[S]. Clinical and Laboratory Standard Institute，2010.
[2] Guidelines for the enumeration of CD4+T lymphocytes in immunosuppressed individuals [J]. CD4+T lymphocyte Working Party. Members of the General Haematology Task Force of BCSH. Clin Lab Haematol，1997，19（4）：231-241.
[3] 中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）[J/OL]，2009 [2013-04-25].http//ncaids.chinacdc.cn/n16/n1193/n4073/n299951.files/n326381.pdf.
[4] 陈铁龙，桂希恩，邓莉萍，等.湖北成人CD4、CD8T淋巴细胞计数正常值调查及CD4与总淋巴细胞数的相关性分析[J].中国艾滋病性病，2005，11（4）：252-254.
[5] 贺健梅，邹潇白，彭瑾瑜，等.湖南省苗族健康人群外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞正常参考值研究[J].中国感染控制杂志，2009，8（2）：82-85.
[6] 陈霞，李娜，牟怀德，等.乐山地区健康成人CD4淋巴细胞计数参考值调查[J].现代预防医学，2007，34（23）：4413-4419.
[7] 蒋卫民，潘孝彰，康来仪，等.上海地区成人不同年龄组间CD4、CD8淋巴细胞计数正常值调查[J].中华传染病杂志，2002，20（4）：203-205.
[8] 宁铁林，朱效科，郑敏娜.天津地区健康人外周血CD4、CD8淋巴细胞正常参考值研究[J].中国慢性病预防与控制，2007，15（5）：432-434.
[9] 卫大英，马名驹，马志凌，等.彝族健康人群外周血 T 淋巴细胞正常参考值研究[J].现代预防医学，2007，34（3）：416-418.
[10] 郭志宏，姚亚萍.浙江地区健康青少年和成人外周血 T淋巴细胞免疫表型调查及正常参考值范围的建立[J].中国预防医学杂志，2008，9（1）：32-35.
（收稿日期：2013-05-07）
[关键词] CD4+T淋巴细胞计数；参考区间；流式细胞术；艾滋病
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）16-18-02
CD4+T淋巴细胞是免疫反应的中心细胞，并为HIV感染的主要靶细胞。人体感染了HIV后，可导致CD4+T淋巴细胞数量的不断减少，从而继发免疫缺陷。CD4+T淋巴细胞计数可以评价HIV感染者免疫状况、预测判断疾病进程、评价抗病毒治疗效果和估测预后，为HIV感染患者免疫系统损害状况最明确的指标。目前，我国尚未建立Partec PAS流式细胞仪计数CD4+T淋巴细胞的生物参考区间，中山地区亦未建立本地区人群的CD4+T淋巴细胞计数生物参考区间。本研究使用Partec PAS流式细胞仪测定了140例中山地区健康成人外周血的CD4+T淋巴细胞数，以确定本地区健康成人外周血CD4+T淋巴细胞的生物参考区间。
1 对象与方法
1.1 研究对象
本研究采用配额抽样的方法，选取140名15～59岁的本地区健康个体，分为5组：15～19岁年龄组，男9名，女8名；
20～29岁年龄组，男17名，女18名；30～39岁年龄组，男20名，女20名；40～49岁年龄组，男15名，女15名；50～59岁年龄组，男9名，女9名。纳入对象需经常规体检无异常，实验室检测HBV表面抗原以及HCV、HIV和梅毒抗体均阴性，谷丙转氨酶和血细胞常规计数均正常。
1.2 检测仪器及试剂
德国Partec公司的PAS型流式细胞仪和配套的CD4+T细胞快速计数试剂、校准标准微球、样品管及鞘液，质控品为BECKMAN IMMUNO-TROLTM Cells。
1.3 标本的采集和检测
采集静脉血2～3mL，置于含K3-EDTA抗凝剂真空采血管；用标准微球对仪器进行校准，然后在样品管中加入20?L抗凝全血，再加入 20?L PE 标记的 CD4 分子抗体，混匀并于室温避光放置10～15min使之充分反应，最后加入 800?L 免洗缓冲液并轻轻混匀上机；质控品与样品同样处理和测定。处理后的样品检测在6h内完成。
1.4 统计学处理
用 SPSS 13.0软件进行统计分析，P<0.05为差异有统
计学意义。各组数据皆呈正态分布且具方差齐性，因此各年龄组间的CD4+T淋巴细胞计数结果均值比较采用方差分析，而相同年龄组男性和女性之间的CD4+T细胞均值比较采用两独立样本t检验，以x±1.96s确定参考区间。
2 结果
2.1 离群值的剔除
根据CLSI C28-A3 文件[1]，各组数据按大小顺序排列后，将疑似离群值与其相邻值的差值（D）和数据全距（R）相除，若D/R>1/3则考虑为离群值。根据该文件规则，男性20～29岁年龄组一数据为离群值而被剔除。
2.2 中山地区健康成人的CD4+T淋巴细胞计数结果
用（）来表示各年龄组不同性别的CD4+T淋巴细胞数，结果见表 1。同性别各年龄组之间以及同年龄组男女之间的CD4+T淋巴细胞计数结果均值的差异均无统计学意义（P均>0.05）；将同性别各年龄组计数结果数据合并后，男性的CD4+T淋巴细胞数为（817.0±182.6）个/?L，女性的CD4+T淋巴细胞数为（792.6±211.9）个/?L；经两独立样本t检验，男性和女性之间的CD4+T淋巴细胞均值差异无统计学意义（t=0.732， P=0.465）。
2.3 中山地区健康成人的外周血CD4+ T淋巴细胞数参考区间
由于所分各组的CD4+T淋巴细胞数均值差异均无统计学意义，因此合并本研究获得的全部个体的CD4+T淋巴细胞计数结果。合并数据呈正态分布，故以（x±1.96s）确定其95%的分布范围，结果为（804.7±387.3）个/?L。
3 讨论
淋巴细胞亚群能反映机体的免疫状况、判断药物疗效，并且还可以预示疾病进展的快慢，因而在感染性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病的研究中越来越受到重视。美国疾病预防控制中心测定成人外周血CD4+T淋巴细胞数的参考范围为（844±247）个/?L，并规定CD4+T淋巴细胞绝对数≤500个/?L作为AIDS诊断依据之一，以此作为HIV感染后需要开始进行抗病毒治疗的实验室指标[2]。然而，外周血中淋巴细胞含量受生活环境、社会经济、种族特点的影响，不同地域及不同种族的正常参考值不尽相同，不同仪器和试剂获得的结果也存在一定的偏差。因此，《全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）》要求各地应建立本地区的包括CD4+T淋巴细胞绝对计数的正常参考范围 [3]。
本研究结果显示，中山地区健康成人外周血CD4+T淋巴细胞的参考范围为（804.7±387.3）个/?L。其变异范围与陈铁龙等[4-5]的研究结果类似，但明显大于美国和国内大都数实验室建立的CD4+T淋巴细胞参考范围[6-10]。这可能与使用的仪器、试剂等的不同有关。另外，本研究结果表明，不同性别和年龄的健康成人外周血CD4+T淋巴细胞之间没有差异，这与已有的大部分研究结果相一致[6-9]。 本研究建立的中山地区健康成人外周血的CD4+T淋巴细胞计数参考范围，可以为本地区艾滋病患者的临床分期诊断、抗病毒治疗效果提供参考依据。由于儿童外周血CD4+T细胞的参考范围与成人不同[3]，我们下一步工作将建立本地区不同年龄段儿童的外周血CD4+T细胞计数的参考范围。
[参考文献]
[1] CLSI C28-A3. Defining，establishing，and verifying reference intervals in the clinical laboratory； approved guideline[S]. Clinical and Laboratory Standard Institute，2010.
[2] Guidelines for the enumeration of CD4+T lymphocytes in immunosuppressed individuals [J]. CD4+T lymphocyte Working Party. Members of the General Haematology Task Force of BCSH. Clin Lab Haematol，1997，19（4）：231-241.
[3] 中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）[J/OL]，2009 [2013-04-25].http//ncaids.chinacdc.cn/n16/n1193/n4073/n299951.files/n326381.pdf.
[4] 陈铁龙，桂希恩，邓莉萍，等.湖北成人CD4、CD8T淋巴细胞计数正常值调查及CD4与总淋巴细胞数的相关性分析[J].中国艾滋病性病，2005，11（4）：252-254.
[5] 贺健梅，邹潇白，彭瑾瑜，等.湖南省苗族健康人群外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞正常参考值研究[J].中国感染控制杂志，2009，8（2）：82-85.
[6] 陈霞，李娜，牟怀德，等.乐山地区健康成人CD4淋巴细胞计数参考值调查[J].现代预防医学，2007，34（23）：4413-4419.
[7] 蒋卫民，潘孝彰，康来仪，等.上海地区成人不同年龄组间CD4、CD8淋巴细胞计数正常值调查[J].中华传染病杂志，2002，20（4）：203-205.
[8] 宁铁林，朱效科，郑敏娜.天津地区健康人外周血CD4、CD8淋巴细胞正常参考值研究[J].中国慢性病预防与控制，2007，15（5）：432-434.
[9] 卫大英，马名驹，马志凌，等.彝族健康人群外周血 T 淋巴细胞正常参考值研究[J].现代预防医学，2007，34（3）：416-418.
[10] 郭志宏，姚亚萍.浙江地区健康青少年和成人外周血 T淋巴细胞免疫表型调查及正常参考值范围的建立[J].中国预防医学杂志，2008，9（1）：32-35.
（收稿日期：2013-05-07）