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【中图分类号】R446.11【文献标识码】A【文章编号】1632-5281（2015）10
摘要 丙氨酸氨基转移酶（ALT）是人体内重要的转移酶之一，血清中该酶的活性变化在临床上具有诊断意义。本文首先对现如今运用较为广泛的几种测定方法进行分析比较，说明其利弊，然后在赖氏法的基础上，对其测定方法进行改良。对于标准曲线的测定以及丙氨酸含量的计算这一重要环节，论文详细阐述了改良实验的设计、实验方法及计算方法的的改进。阐述中，利用实验数据及表格对于改良前后的实验进行比较、论证。最后对改良后的实验方法和结果进行分析。
关键词
丙氨酸氨基转移酶（ALT）；丙酮酸；酶活性
ALT在肝细胞中含量较多，且主要存在于肝细胞的可溶性部分，当肝脏受损时，此酶可释放人血，致血中该酶活性浓度增加，故测定ALT常作为判断肝细胞损伤的灵敏指标，但其他疾病或因素亦会引起ALT不同程度的增高。
目前测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的方法主要分为两类，一类是分光光度法，另一类是比色法。前者是测定酶速率的方法，需要紫外分光光度计与酶试剂。后者有金式（King）法，穆氏（Mohum）法与赖氏（Reitman Frankel）法3种。这3种方法是目前国内测定ALT的主要方法，他们的测定原理、试剂和操作步骤及采用温度等方面均完全相同，主要不同点为酶与底物的作用时间、标准曲线绘制方法和单位定义。在作用时间上，金氏为60min，其余两法均为30min。在单位上，金氏法的单位是100ml血清与足量丙氨酸、α-酮戊二酸在pH7.4，37℃保温1h，每生成1μmol丙酮酸，称为一个丙氨酸氨基转移酶活力单位；穆氏法的单位定义是每毫升血清在pH7.4，37℃保温条件下与底物作用30min，每生成2.5μg丙酮酸为一个单位；赖氏法的单位定义是血清1ml，反应总液量3ml，在25℃、340nm光波下，光径1cm，1min使光密度降低0.001为一个单位。
由于改良穆氏法单位定义不合理，金氏法酶作用的时间较长等缺点，因此目前临床上采用赖氏法进行检测。
基于上述研究状况和现有研究工作基础，本项目组拟定利用赖氏法进行血清丙氨酸氨基转移酶的测定方法的改良。
一、材料与方法
1.器材与试剂
1.1器材
恒温水浴锅、7200型分光光度计、刻度吸量管、滴管、试管、移液枪等。
2.试剂
（1） 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：称取无水磷酸二氢钾（KH2PO4）2.176g和磷酸氢二钾（Na2HPO4）11，928g，加少量蒸馏水溶解后移至1000mL容量瓶中，校正pH到7.4，然后加蒸馏水至刻度。贮存于冰箱中备用。
（2）丙氨酸氨基转移酶底物液（pH7.4）：精确称取DL-丙氨酸1.79g和α-酮戊二酸29.2mg于烧杯，加入0.1mol/L磷酸盐缓冲液80ml，煮沸溶解冷却，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.4，再用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释到100mL。充分混匀，冰箱保存，可保存一周。
（3）1mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液：精确称取2，4-二硝基苯肼19.8mg，用10mo1/L盐酸10mL稀释至100mL过滤后使用。
（4） 0.4mol/L氢氧化钠溶液。
（5）丙酮酸标准液（2μmol/ml）：精确称取丙酮酸钠22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至刻度。此试剂需现用现配。
（6）α-酮戊二酸标准液（2μmol/ml）：精确称取α-酮戊二酸29.2mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至刻度。
二、 实验设计
1.假设实验（标准曲线的制作）：取干燥洁净试管8支，编号，按下表加入试剂，混匀：
分别在500nm，510nm，520nm波长下进行比色，以空白管调零，读取各管吸光值，以吸光值为为纵坐标，以丙酮酸和α-酮戊二酸的物质的量为横坐标绘制标准曲线。
2. 比较实验（赖氏法）：取干燥洁净试管6支，编号，按下表加入试剂，混匀：
各管混匀，于室温静置10分钟，在510nm波长下进行比色，以空白管调零，以吸光值为纵坐标，以丙酮酸的量为横坐标绘制标准曲线。
3.酶活性的测定：
（1）取干燥洁净试管2支，标明测定管和对照管，按下表操作：
混匀，静置10min，以蒸馏水调零，在520nm波长下进行比色，读取测定管和对照管光密度。
以测定管光密度值代入，然后从标准曲线上查出其丙酮酸的量。由赖氏法得到的酶活力单位与丙酮酸量的标准曲线，可查出酶活力单位。
三、 实验结果与计算
根据步骤一，得到下列数据结果。
根据上述数据绘及步骤一制标准曲线，如下图表：
根据朗伯比尔定律，A=KCL代入以上数据，可列方程组计算出在实验中参与反应的丙酮酸的物质的量。
根据步骤二和三，得到丙酮酸的量为
由y=0.0027x，实验组的吸光值，代入标准曲可得到该酶活力单位为89.6。
三.结果分析
1.由上述假设实验中的图表可以看出，丙酮酸和α-酮戊二酸吸收光谱曲线有差别，且500～520nm处差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙4倍。说明原实验的操作及计算方法存在着一定的误差。
2.根据传统的赖氏法和改良后赖氏法这两种方法来测定血清丙氨酸氨基转移酶ALT的活性，最终得到的结果有不同，且运用改良后赖氏法所得出的结果更精确，证明改良后的方法可以减少一定的误差。
3.在患各种肝炎急性期、药物中毒性肝细胞坏死等疾病时，血清丙氨酸氨基转移酶活力明显增高；在患肝癌、肝硬化、慢性肝炎、心肌梗死等疾病时，血清丙氨酸氨基转移酶活性也会明显增高，而患阻塞性黄疸、胆管炎等疾病时，此酶活性仅轻度升高。因此对于其测定方法应越精确越好，该方法的改良在一定程度上排除了误差，对于精确度有一定的提高，可以更好的应用于临床。
摘要 丙氨酸氨基转移酶（ALT）是人体内重要的转移酶之一，血清中该酶的活性变化在临床上具有诊断意义。本文首先对现如今运用较为广泛的几种测定方法进行分析比较，说明其利弊，然后在赖氏法的基础上，对其测定方法进行改良。对于标准曲线的测定以及丙氨酸含量的计算这一重要环节，论文详细阐述了改良实验的设计、实验方法及计算方法的的改进。阐述中，利用实验数据及表格对于改良前后的实验进行比较、论证。最后对改良后的实验方法和结果进行分析。
关键词
丙氨酸氨基转移酶（ALT）；丙酮酸；酶活性
ALT在肝细胞中含量较多，且主要存在于肝细胞的可溶性部分，当肝脏受损时，此酶可释放人血，致血中该酶活性浓度增加，故测定ALT常作为判断肝细胞损伤的灵敏指标，但其他疾病或因素亦会引起ALT不同程度的增高。
目前测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的方法主要分为两类，一类是分光光度法，另一类是比色法。前者是测定酶速率的方法，需要紫外分光光度计与酶试剂。后者有金式（King）法，穆氏（Mohum）法与赖氏（Reitman Frankel）法3种。这3种方法是目前国内测定ALT的主要方法，他们的测定原理、试剂和操作步骤及采用温度等方面均完全相同，主要不同点为酶与底物的作用时间、标准曲线绘制方法和单位定义。在作用时间上，金氏为60min，其余两法均为30min。在单位上，金氏法的单位是100ml血清与足量丙氨酸、α-酮戊二酸在pH7.4，37℃保温1h，每生成1μmol丙酮酸，称为一个丙氨酸氨基转移酶活力单位；穆氏法的单位定义是每毫升血清在pH7.4，37℃保温条件下与底物作用30min，每生成2.5μg丙酮酸为一个单位；赖氏法的单位定义是血清1ml，反应总液量3ml，在25℃、340nm光波下，光径1cm，1min使光密度降低0.001为一个单位。
由于改良穆氏法单位定义不合理，金氏法酶作用的时间较长等缺点，因此目前临床上采用赖氏法进行检测。
基于上述研究状况和现有研究工作基础，本项目组拟定利用赖氏法进行血清丙氨酸氨基转移酶的测定方法的改良。
一、材料与方法
1.器材与试剂
1.1器材
恒温水浴锅、7200型分光光度计、刻度吸量管、滴管、试管、移液枪等。
2.试剂
（1） 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：称取无水磷酸二氢钾（KH2PO4）2.176g和磷酸氢二钾（Na2HPO4）11，928g，加少量蒸馏水溶解后移至1000mL容量瓶中，校正pH到7.4，然后加蒸馏水至刻度。贮存于冰箱中备用。
（2）丙氨酸氨基转移酶底物液（pH7.4）：精确称取DL-丙氨酸1.79g和α-酮戊二酸29.2mg于烧杯，加入0.1mol/L磷酸盐缓冲液80ml，煮沸溶解冷却，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.4，再用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释到100mL。充分混匀，冰箱保存，可保存一周。
（3）1mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液：精确称取2，4-二硝基苯肼19.8mg，用10mo1/L盐酸10mL稀释至100mL过滤后使用。
（4） 0.4mol/L氢氧化钠溶液。
（5）丙酮酸标准液（2μmol/ml）：精确称取丙酮酸钠22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至刻度。此试剂需现用现配。
（6）α-酮戊二酸标准液（2μmol/ml）：精确称取α-酮戊二酸29.2mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至刻度。
二、 实验设计
1.假设实验（标准曲线的制作）：取干燥洁净试管8支，编号，按下表加入试剂，混匀：
分别在500nm，510nm，520nm波长下进行比色，以空白管调零，读取各管吸光值，以吸光值为为纵坐标，以丙酮酸和α-酮戊二酸的物质的量为横坐标绘制标准曲线。
2. 比较实验（赖氏法）：取干燥洁净试管6支，编号，按下表加入试剂，混匀：
各管混匀，于室温静置10分钟，在510nm波长下进行比色，以空白管调零，以吸光值为纵坐标，以丙酮酸的量为横坐标绘制标准曲线。
3.酶活性的测定：
（1）取干燥洁净试管2支，标明测定管和对照管，按下表操作：
混匀，静置10min，以蒸馏水调零，在520nm波长下进行比色，读取测定管和对照管光密度。
以测定管光密度值代入，然后从标准曲线上查出其丙酮酸的量。由赖氏法得到的酶活力单位与丙酮酸量的标准曲线，可查出酶活力单位。
三、 实验结果与计算
根据步骤一，得到下列数据结果。
根据上述数据绘及步骤一制标准曲线，如下图表：
根据朗伯比尔定律，A=KCL代入以上数据，可列方程组计算出在实验中参与反应的丙酮酸的物质的量。
根据步骤二和三，得到丙酮酸的量为
由y=0.0027x，实验组的吸光值，代入标准曲可得到该酶活力单位为89.6。
三.结果分析
1.由上述假设实验中的图表可以看出，丙酮酸和α-酮戊二酸吸收光谱曲线有差别，且500～520nm处差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙4倍。说明原实验的操作及计算方法存在着一定的误差。
2.根据传统的赖氏法和改良后赖氏法这两种方法来测定血清丙氨酸氨基转移酶ALT的活性，最终得到的结果有不同，且运用改良后赖氏法所得出的结果更精确，证明改良后的方法可以减少一定的误差。
3.在患各种肝炎急性期、药物中毒性肝细胞坏死等疾病时，血清丙氨酸氨基转移酶活力明显增高；在患肝癌、肝硬化、慢性肝炎、心肌梗死等疾病时，血清丙氨酸氨基转移酶活性也会明显增高，而患阻塞性黄疸、胆管炎等疾病时，此酶活性仅轻度升高。因此对于其测定方法应越精确越好，该方法的改良在一定程度上排除了误差，对于精确度有一定的提高，可以更好的应用于临床。