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[摘要] 目的 研究Klotho基因多态性与中国汉族人群衰老的关系。 方法 在482例（<60岁236例，60岁246例）沈阳地区健康汉族人群，采用Snapshot（微测序） 的方法检测Klotho基因标签SNP（TagSNP）-rs571118位点和功能SNP位点rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）的基因型，观察Klotho基因多态性与衰老的关系。结果 证实在中国汉族人群F352V（rs9536314）为G纯合子，C370S（rs9527025）为T纯合子；rs571118位点存在AA，GG，AG基因型。老年人群基因型分布为（AA35（14.22），AG132（53.65），GG79（32.11）），年轻人群基因型分布为（AA51（21.61），AG128（54.23），GG57（24.15））。Klotho基因rs571118位点G等位基因频率在老年人群高于年轻人群。结论 Klotho基因rs571118位点多态性与衰老存在明显相关。
[关键词] 衰老；Klotho基因；单核苷酸多态性
[中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）10-09-03
遗传因素在衰老中起到重要作用[1]，而基因是遗传信息的载体和遗传物质的最小功能单位。衰老学家们认为，衰老并非单一基因决定，而是一连串基因激活和阻抑及各自产物相互作用的结果。内、外环境，如氧自由基等损伤因素都可以影响DNA（特别是线粒体DNA）的稳定性，加速衰老进程。衰老时人体机能下降，对疾病的易感性增强。而基因多态性位点的变化，可能影响基因的表达水平，进而影响蛋白质的功能。弄清衰老基因的功能、调控、影响因素可能是弄清衰老机制的一条重要途径。Klotho是一种抗衰老基因。Klotho作为一种辅助因子/复合受体调节成纤维细胞生长因子（FGF）23信号，影响细胞内信号通路包括p53/p21，cAMP，蛋白激酶C（PKC）和Wnt信号通路。Klotho保护内皮的机能障碍和调节一氧化氮的产生，Klotho基因表达增加，能通过
抑制胰岛素信号和氧化应激进而抑制衰老和延长寿命[2]。人类Klotho基因的多态性相关于多种衰老相关疾病和紊乱的易感性增加。在1187白种人的研究中发现，在启动子区域（G-395A）和一个外显子4（C1818T，）的单倍型和老年绝经后妇女的骨质密度显著相关[3]，在韩国的研究发现，年龄差异影响Klotho G-395A和C1818T多态性与CAD的关联性[4]。本研究对Klotho基因基因多态性与沈阳地区中国健康汉族人群衰老的的关系进行了研究，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2008年10月～2009年5月志愿者，男669例和女684例，经过查体，询问病史、血尿常规、血生化、胸片、腹部超声、心血管超声、肺功能的检查，筛查出482例“健康”志愿者，均为沈阳市汉族居民，其中男228例，女254例，年龄35～91岁。
1.2 主要仪器和试剂
-80℃冰箱（SANYO Japan）；高速低温离心机（Sigma USA）；ABI 3730xl DNA测序仪（ABI USA）；凝胶自动成像及分析系统Chemi Imager 5500（Alpha Innotech USA）。
1.3 方法
1.3.1 血标本采集 所有研究对象抽取清晨空腹外周静脉血3 mL，2000 rpm离心15 min，弃上清，取血凝块储存于-80℃冰箱内备用。
1.3.2 基因组DNA的提取 取血凝块，使用天根RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统提取基因DNA，按试剂盒说明操作。
1.3.3 Klotho基因SNP位点的选取 在Hapmap数据库中下载Klotho基因的中国汉族人群的SNP基因型和等位基因数据，用Haploview软件进行分析选择tagSNP rs571118位点和两个功能SNP位点rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）。选定SNP位点后，首先用30个DNA样品进行基因型分析，SNP位点杂合度大于5%则进行大样本的基因型鉴定。
1.3.4 Snapshot检测及测序 使用Snapshot（ABI）试剂盒进行单碱基延伸反应。反应体系：3μL Snapshot mix；2μL延伸引物以；l μL纯化的PCR产物。循环参数：96℃预变性1 min，96℃变性10 s，52℃退火5 s，60℃延伸30 s，共28个循环。微测序产物中加入1U SAP，37℃孵育60 min，75℃再孵育15 min，进行纯化处理，去除多余的引物和ddNTP。
每份样品加入甲酰胺9μL，0.25μL内标Lizl20（ABI）和纯化的微测序产物 1μL，95℃变性5 min后迅速放在冰上淬火2 min，在ABI的PRISMR3730xl DNA测序仪上进行毛细管电泳，运行GeneMarker V1.6分析软件分析实验结果。
2 结果
30个DNA样品分型后后发现两个功能SNP位点rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）为纯合子。放弃进一步扩大样本进行检测，而rs571118位点存在存在AA，GG，AG基因型。
Klotho基因的rs571118位点衰老与对照组的基因型及基因频率相比较，见表1。衰老组的各个基因型与年轻组相比存在差异（x2=4.48，P=0.034<0.05）；等位基因频率在两组间比较，差异有统计学意义（x2=5.73，P=0.016，OR=1.364，95%CI：1.058～1.760）。
3 讨论 Klotho基因（MIM：604824）位于染色体13q12，包含5个外显子，跨越近50 kb的基因组DNA，是一个衰老抑制基因[5]。过表达Klotho小鼠寿命延长；当敲除Klotho后，小鼠（klotho-/-）表现出诸多衰老相关的表型，如寿命缩短、不育、动脉粥样硬化、皮肤萎缩、肺气肿、步态障碍、异位钙化、骨质减少/骨质疏松症、肺气肿、脑垂体异常和异常的钙代谢[6]。在人群为基础的相关性研究中，Klotho基因也相关于一些衰老的表型如骨质减少/骨质疏松，动脉硬化和钙异常[2]。意大利的Chianti研究发现Klotho浓度是社区居住的老年人死亡率的独立预测因子[7]。Klotho基因和衰老相关通路insulin/IGF-1信号通路相关，它可能通过对于氧化应激的抵抗而实现延迟衰老的功能[8]。Klotho作为一个辅因子增加Klotho纤维母细胞生长因子（FGFR）复合体结合到FGF23的结合力[9]。
Klotho基因的以KL-VS（F352V（rs9536314）和（C370S（rs9527025））位点为代表性的一些SNP位点受到广泛研究。在意大利中北部，对总共1089名（669名女性和420名男性）从19～109岁无血缘关系的个体进行的研究，将研究对象划分为3个年龄段-年轻组、老年组和百岁老人组。比较Klotho基因KL-VS等位基因频率，Klotho的杂合子基因型在老人与青年对照组相比有显著的增加，而百岁老人和青年组之间无明显差异[10]。在英国982名白种健康女性的研究发现Klotho基因的4个SNP位点-395 G–A，1110 G–A，1818 C–T，2298 C–T和白细胞端粒长度不相关[11]。在韩国的的心血管病患者中观察Klotho G-395A 和C1818T不同的多态表型对衰老的影响。同一位点在不同研究的结果不同也说明了人种和种族的差别对于基因频率有较大影响。
为了探讨Klotho基因多态性在衰老中所起到的潜在的作用，排除一些干扰因素如肿瘤，一些衰老相关的疾病和其他疾病的影响。在本研究中我们应用tagSNP策略选择了Klotho基因的tagSNP位点rs571118进行研究，发现Klotho基因rs571118位点G等位基因频率在老年人群高于年轻人群。本研究提示Klotho基因rs571118位点可能和中国沈阳地区汉族健康人群的衰老相关联。
[参考文献]
[1] Kenyon CJ.The genetics of ageing [J].Nature，2010，464（7288）：504-512.
[2] Hu MC，Shiizaki K，Kuro-o M，et al.Fibroblast Growth Factor 23 and Klotho：Physiology and Pathophysiology of an Endocrine Network of Mineral Metabolism[J].Physiology，2013，75（1）：50，33.
[3] Kawano KI，Ogata N，Chiano M，et al.Klotho gene polymorphisms associated with bone density of aged postmenopausal women[J].Journal of Bone and Mineral Research，2002，17（10）：1744-1751.
[4] Rhee E-J，Oh K-W，Lee W-Y，et al.The differential effects of age on the association of KLOTHO gene polymorphisms with coronary artery disease[J].Metabolism： clinical and experimental，2006，55（10）：1344.
[5] Manolis AS.Klotho，Spinning the Thread of Life：an Anti-Ageing Gene[J].Hospital Chronicles，2012，7（3）：129-132.
[6] Chen T-H，Kuro-o M，Chen C-H，et al.The secreted Klotho protein restores phosphate retention and suppresses accelerated aging in Klotho mutant mice[J].European journal of pharmacology，2012，698（1-3）：67-73.
[7] Hu MC，Shi M，Zhang J，et al.Klotho deficiency causes vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology[J].2011，22（1）：124-136.
[8] Semba RD，Cappola AR，Sun K，et al.Plasma klotho and mortality risk in older community-dwelling adults[J]. The Journals of Gerontology Series A：Biological Sciences and Medical Sciences，2011，66（7）：794-800.
[9] Papaconstantinou J.Insulin/IGF-1 and ROS signaling pathway cross-talk in aging and longevity determination[J].Molecular and cellular endocrinology，2009，299（1）：89-100.
[10] Invidia L，Salvioli S，Altilia S，et al.The frequency of Klotho KL-VS polymorphism in a large Italian population，from young subjects to centenarians，suggests the presence of specific time windows for its effect[J].Biogerontology，2010，11（1）：67-73.
[11] Zhang F，Kato BS，Gardner JP，et al.Lack of association between leukocyte telomere length and genetic variants in two ageing-related candidate genes[J].Mechanisms of ageing and development，2007， 128（7）：415-422.
（收稿日期：2013-03-14）
[关键词] 衰老；Klotho基因；单核苷酸多态性
[中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）10-09-03
遗传因素在衰老中起到重要作用[1]，而基因是遗传信息的载体和遗传物质的最小功能单位。衰老学家们认为，衰老并非单一基因决定，而是一连串基因激活和阻抑及各自产物相互作用的结果。内、外环境，如氧自由基等损伤因素都可以影响DNA（特别是线粒体DNA）的稳定性，加速衰老进程。衰老时人体机能下降，对疾病的易感性增强。而基因多态性位点的变化，可能影响基因的表达水平，进而影响蛋白质的功能。弄清衰老基因的功能、调控、影响因素可能是弄清衰老机制的一条重要途径。Klotho是一种抗衰老基因。Klotho作为一种辅助因子/复合受体调节成纤维细胞生长因子（FGF）23信号，影响细胞内信号通路包括p53/p21，cAMP，蛋白激酶C（PKC）和Wnt信号通路。Klotho保护内皮的机能障碍和调节一氧化氮的产生，Klotho基因表达增加，能通过
抑制胰岛素信号和氧化应激进而抑制衰老和延长寿命[2]。人类Klotho基因的多态性相关于多种衰老相关疾病和紊乱的易感性增加。在1187白种人的研究中发现，在启动子区域（G-395A）和一个外显子4（C1818T，）的单倍型和老年绝经后妇女的骨质密度显著相关[3]，在韩国的研究发现，年龄差异影响Klotho G-395A和C1818T多态性与CAD的关联性[4]。本研究对Klotho基因基因多态性与沈阳地区中国健康汉族人群衰老的的关系进行了研究，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2008年10月～2009年5月志愿者，男669例和女684例，经过查体，询问病史、血尿常规、血生化、胸片、腹部超声、心血管超声、肺功能的检查，筛查出482例“健康”志愿者，均为沈阳市汉族居民，其中男228例，女254例，年龄35～91岁。
1.2 主要仪器和试剂
-80℃冰箱（SANYO Japan）；高速低温离心机（Sigma USA）；ABI 3730xl DNA测序仪（ABI USA）；凝胶自动成像及分析系统Chemi Imager 5500（Alpha Innotech USA）。
1.3 方法
1.3.1 血标本采集 所有研究对象抽取清晨空腹外周静脉血3 mL，2000 rpm离心15 min，弃上清，取血凝块储存于-80℃冰箱内备用。
1.3.2 基因组DNA的提取 取血凝块，使用天根RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统提取基因DNA，按试剂盒说明操作。
1.3.3 Klotho基因SNP位点的选取 在Hapmap数据库中下载Klotho基因的中国汉族人群的SNP基因型和等位基因数据，用Haploview软件进行分析选择tagSNP rs571118位点和两个功能SNP位点rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）。选定SNP位点后，首先用30个DNA样品进行基因型分析，SNP位点杂合度大于5%则进行大样本的基因型鉴定。
1.3.4 Snapshot检测及测序 使用Snapshot（ABI）试剂盒进行单碱基延伸反应。反应体系：3μL Snapshot mix；2μL延伸引物以；l μL纯化的PCR产物。循环参数：96℃预变性1 min，96℃变性10 s，52℃退火5 s，60℃延伸30 s，共28个循环。微测序产物中加入1U SAP，37℃孵育60 min，75℃再孵育15 min，进行纯化处理，去除多余的引物和ddNTP。
每份样品加入甲酰胺9μL，0.25μL内标Lizl20（ABI）和纯化的微测序产物 1μL，95℃变性5 min后迅速放在冰上淬火2 min，在ABI的PRISMR3730xl DNA测序仪上进行毛细管电泳，运行GeneMarker V1.6分析软件分析实验结果。
2 结果
30个DNA样品分型后后发现两个功能SNP位点rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）为纯合子。放弃进一步扩大样本进行检测，而rs571118位点存在存在AA，GG，AG基因型。
Klotho基因的rs571118位点衰老与对照组的基因型及基因频率相比较，见表1。衰老组的各个基因型与年轻组相比存在差异（x2=4.48，P=0.034<0.05）；等位基因频率在两组间比较，差异有统计学意义（x2=5.73，P=0.016，OR=1.364，95%CI：1.058～1.760）。
3 讨论 Klotho基因（MIM：604824）位于染色体13q12，包含5个外显子，跨越近50 kb的基因组DNA，是一个衰老抑制基因[5]。过表达Klotho小鼠寿命延长；当敲除Klotho后，小鼠（klotho-/-）表现出诸多衰老相关的表型，如寿命缩短、不育、动脉粥样硬化、皮肤萎缩、肺气肿、步态障碍、异位钙化、骨质减少/骨质疏松症、肺气肿、脑垂体异常和异常的钙代谢[6]。在人群为基础的相关性研究中，Klotho基因也相关于一些衰老的表型如骨质减少/骨质疏松，动脉硬化和钙异常[2]。意大利的Chianti研究发现Klotho浓度是社区居住的老年人死亡率的独立预测因子[7]。Klotho基因和衰老相关通路insulin/IGF-1信号通路相关，它可能通过对于氧化应激的抵抗而实现延迟衰老的功能[8]。Klotho作为一个辅因子增加Klotho纤维母细胞生长因子（FGFR）复合体结合到FGF23的结合力[9]。
Klotho基因的以KL-VS（F352V（rs9536314）和（C370S（rs9527025））位点为代表性的一些SNP位点受到广泛研究。在意大利中北部，对总共1089名（669名女性和420名男性）从19～109岁无血缘关系的个体进行的研究，将研究对象划分为3个年龄段-年轻组、老年组和百岁老人组。比较Klotho基因KL-VS等位基因频率，Klotho的杂合子基因型在老人与青年对照组相比有显著的增加，而百岁老人和青年组之间无明显差异[10]。在英国982名白种健康女性的研究发现Klotho基因的4个SNP位点-395 G–A，1110 G–A，1818 C–T，2298 C–T和白细胞端粒长度不相关[11]。在韩国的的心血管病患者中观察Klotho G-395A 和C1818T不同的多态表型对衰老的影响。同一位点在不同研究的结果不同也说明了人种和种族的差别对于基因频率有较大影响。
为了探讨Klotho基因多态性在衰老中所起到的潜在的作用，排除一些干扰因素如肿瘤，一些衰老相关的疾病和其他疾病的影响。在本研究中我们应用tagSNP策略选择了Klotho基因的tagSNP位点rs571118进行研究，发现Klotho基因rs571118位点G等位基因频率在老年人群高于年轻人群。本研究提示Klotho基因rs571118位点可能和中国沈阳地区汉族健康人群的衰老相关联。
[参考文献]
[1] Kenyon CJ.The genetics of ageing [J].Nature，2010，464（7288）：504-512.
[2] Hu MC，Shiizaki K，Kuro-o M，et al.Fibroblast Growth Factor 23 and Klotho：Physiology and Pathophysiology of an Endocrine Network of Mineral Metabolism[J].Physiology，2013，75（1）：50，33.
[3] Kawano KI，Ogata N，Chiano M，et al.Klotho gene polymorphisms associated with bone density of aged postmenopausal women[J].Journal of Bone and Mineral Research，2002，17（10）：1744-1751.
[4] Rhee E-J，Oh K-W，Lee W-Y，et al.The differential effects of age on the association of KLOTHO gene polymorphisms with coronary artery disease[J].Metabolism： clinical and experimental，2006，55（10）：1344.
[5] Manolis AS.Klotho，Spinning the Thread of Life：an Anti-Ageing Gene[J].Hospital Chronicles，2012，7（3）：129-132.
[6] Chen T-H，Kuro-o M，Chen C-H，et al.The secreted Klotho protein restores phosphate retention and suppresses accelerated aging in Klotho mutant mice[J].European journal of pharmacology，2012，698（1-3）：67-73.
[7] Hu MC，Shi M，Zhang J，et al.Klotho deficiency causes vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology[J].2011，22（1）：124-136.
[8] Semba RD，Cappola AR，Sun K，et al.Plasma klotho and mortality risk in older community-dwelling adults[J]. The Journals of Gerontology Series A：Biological Sciences and Medical Sciences，2011，66（7）：794-800.
[9] Papaconstantinou J.Insulin/IGF-1 and ROS signaling pathway cross-talk in aging and longevity determination[J].Molecular and cellular endocrinology，2009，299（1）：89-100.
[10] Invidia L，Salvioli S，Altilia S，et al.The frequency of Klotho KL-VS polymorphism in a large Italian population，from young subjects to centenarians，suggests the presence of specific time windows for its effect[J].Biogerontology，2010，11（1）：67-73.
[11] Zhang F，Kato BS，Gardner JP，et al.Lack of association between leukocyte telomere length and genetic variants in two ageing-related candidate genes[J].Mechanisms of ageing and development，2007， 128（7）：415-422.
（收稿日期：2013-03-14）