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随着动物细胞培养技术的不断改进，灌注培养体系以其特有的优势取得了广泛的发展。本文依据不同灌注培养系统的特点划分分为微载体悬浮灌注培养、悬浮细胞截流灌注培养、流化床及固定床灌注培养等几类，并对各类型的灌注体系进行了概述。
【关键词】 灌注培养；微载体；细胞截留
随着单克隆抗体药物产业的发展，带动了大规模动物细胞培养技术的不断提高。利用动物细胞生产单克隆抗体已成为当前生物制药企业的发展方向。在上世纪六十年代，灌注培养技术的出现为动物细胞大规模培养开辟了广阔的前景。在随后的研究中，灌注培养技术得到了迅速发展，已成为动物细胞大规模培养的重要方法。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并带走代谢副产物，而细胞保留在反应器系统中，由于细胞生长环境优良，可以达到很高的细胞密度，并延长表达时间、增大收获体积，同其它方法相比，灌注培养的产率可以提高很多。
1 悬浮灌注培养
1.1 微载体悬浮灌注培养
微载体培养最先是由A1 L1 Van Wezel提出，其方法是在细胞培养时，将细胞悬液与经过特殊处理的微载体混合培养，待细胞贴附于微载体上后移至培养液中培养，借助搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中。近年来随着对微载体材料的深入探索，相继开发出液体微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA 微载体、藻酸盐凝胶微载体等，并有很多微载体已进行商业化生产，如明胶微载体Gelibead 、Cultispher 、Cytodex3和Microsphere以及大孔的Cellsnow和Cytopore等。
1.2 悬浮细胞截流灌注培养
随着无血清悬浮培养技术的日趋成熟，现有细胞密度及表达量已不能满足需求，人们重新将目光转移到灌注培养上，但是如何不用微载体而将细胞截流在反应器中并结合无血清悬浮培养工艺进行产物的表达成为热门。该工艺的重点在细胞截流上，如何高效的截流细胞而不对细胞产生损害及降低堵塞成为焦点。
1.2.1 中空纤维柱细胞截流装置
中空纤维柱是由若干根孔径在10kd-0.45um的圆筒形膜束捆绑在一起构成的，含细胞液由圆筒中间快速通过形成切向流，因膜的孔径小于细胞直径，因此细胞被截流在膜内侧，而培养液透过膜渗出到膜外侧而达到截流细胞的目的。当前该种灌注培养装置最具代表的就是ATF System(Refine TECHNOLOGY ），其特有技术可有效防止柱体的堵塞，达到长时间截流细胞的目的。据报道，应用该系统进行悬浮细胞培养密度可达4-15×107个/ml，蛋白产量可达1g/L/day甚至更高。
图1 ATF系统运行示意图
1.2.2 沉降法细胞截流
在众多的细胞截留装置中，倾斜式重力沉降器由于设备简单、对细胞造成的损伤较小、操作简易，已用于杂交瘤和CHO 细胞连续灌注培养，在采用上流式沉降操作的连续灌注培养生物反应器系统中实现了高密度培养。但该系统在进行细胞培养时还存在诸如细胞损失、灌注流速过慢等问题而限制了系统的放大，无法应用于商业化生产。
1.2.3 声学细胞截流装置
这是一种基于声频引起细胞聚集的新型细胞截留装置，BioSep声学细胞截流设备（Applikon ）的原理完全是基于温和的声频引起松的细胞积聚，然后再沉淀。与其他的细胞分离技术相比，BioSep内的声频能量网构成一个“虚拟网”，因而是更好的，无接触、不移动的过滤模式。该技术可以进行长达数千小时的连续培养，因而大大提高细胞密度、生产率并获得高的产品质量。
1.2.4 离心细胞分离
该方法较为简单，即在无菌条件下利用重力离心分离细胞与培养液，但该方法使细胞受到的剪切力较大，对细胞损伤较大，另外，对操作环境要求较高及离心机体积上的限制而无法应用于大规模生产，仅在研究中应用。
2 床层灌注培养
2.1 流化床培养
利用一些诸如磁、电场等技术手段将微载体局限于一定区域内，细胞生长于多孔微载体内部，培养基在流通过程中不会损失细胞，该培养方式适用于贴壁依赖型细胞，具有培养基交换快，细胞养分充足的特点。
2.2 固定床培养
是将微载体固定于无菌容器内，细胞贴附生长在载体上或载体内部，进行培养液更换时，微载体并不移动，可很大程度上降低血清的用量。
2.2.1 中空纤维灌注培养
由于中空纤维培养系统具有类似于生理状态的纤维毛细管模式和灌注式培养基循坏系统, 既有利于高密度细胞在纤维管壁和周围的停留、生长和增殖, 也便于营养物质的供应和代谢产物的转移, 近年来, 已被越来越多地用于杂交瘤细胞的体外培养。
2.2.2 堆积床培养
该方式是将反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。
灌注培养操作的共同优点是：①细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度，一般可达107-109个/ml，从而较大的提高了产量；②连续灌流系统使细胞稳定的处在较好的营养环境中，有害代谢废物积累较低；③反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率；④产品在罐内停留时间短，可及时回收，有利于保持产品的活性。目前应用连续灌流工艺的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。连续灌注培养法是近年来用于哺乳动物细胞培养生产分泌型重组治疗性药物和嵌合抗体，以及人源化抗体等基因工程抗体较为推崇的一种操作方式。
作者简介：吕中华，男，硕士，哈药集团药物研究院
【关键词】 灌注培养；微载体；细胞截留
随着单克隆抗体药物产业的发展，带动了大规模动物细胞培养技术的不断提高。利用动物细胞生产单克隆抗体已成为当前生物制药企业的发展方向。在上世纪六十年代，灌注培养技术的出现为动物细胞大规模培养开辟了广阔的前景。在随后的研究中，灌注培养技术得到了迅速发展，已成为动物细胞大规模培养的重要方法。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并带走代谢副产物，而细胞保留在反应器系统中，由于细胞生长环境优良，可以达到很高的细胞密度，并延长表达时间、增大收获体积，同其它方法相比，灌注培养的产率可以提高很多。
1 悬浮灌注培养
1.1 微载体悬浮灌注培养
微载体培养最先是由A1 L1 Van Wezel提出，其方法是在细胞培养时，将细胞悬液与经过特殊处理的微载体混合培养，待细胞贴附于微载体上后移至培养液中培养，借助搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中。近年来随着对微载体材料的深入探索，相继开发出液体微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA 微载体、藻酸盐凝胶微载体等，并有很多微载体已进行商业化生产，如明胶微载体Gelibead 、Cultispher 、Cytodex3和Microsphere以及大孔的Cellsnow和Cytopore等。
1.2 悬浮细胞截流灌注培养
随着无血清悬浮培养技术的日趋成熟，现有细胞密度及表达量已不能满足需求，人们重新将目光转移到灌注培养上，但是如何不用微载体而将细胞截流在反应器中并结合无血清悬浮培养工艺进行产物的表达成为热门。该工艺的重点在细胞截流上，如何高效的截流细胞而不对细胞产生损害及降低堵塞成为焦点。
1.2.1 中空纤维柱细胞截流装置
中空纤维柱是由若干根孔径在10kd-0.45um的圆筒形膜束捆绑在一起构成的，含细胞液由圆筒中间快速通过形成切向流，因膜的孔径小于细胞直径，因此细胞被截流在膜内侧，而培养液透过膜渗出到膜外侧而达到截流细胞的目的。当前该种灌注培养装置最具代表的就是ATF System(Refine TECHNOLOGY ），其特有技术可有效防止柱体的堵塞，达到长时间截流细胞的目的。据报道，应用该系统进行悬浮细胞培养密度可达4-15×107个/ml，蛋白产量可达1g/L/day甚至更高。
图1 ATF系统运行示意图
1.2.2 沉降法细胞截流
在众多的细胞截留装置中，倾斜式重力沉降器由于设备简单、对细胞造成的损伤较小、操作简易，已用于杂交瘤和CHO 细胞连续灌注培养，在采用上流式沉降操作的连续灌注培养生物反应器系统中实现了高密度培养。但该系统在进行细胞培养时还存在诸如细胞损失、灌注流速过慢等问题而限制了系统的放大，无法应用于商业化生产。
1.2.3 声学细胞截流装置
这是一种基于声频引起细胞聚集的新型细胞截留装置，BioSep声学细胞截流设备（Applikon ）的原理完全是基于温和的声频引起松的细胞积聚，然后再沉淀。与其他的细胞分离技术相比，BioSep内的声频能量网构成一个“虚拟网”，因而是更好的，无接触、不移动的过滤模式。该技术可以进行长达数千小时的连续培养，因而大大提高细胞密度、生产率并获得高的产品质量。
1.2.4 离心细胞分离
该方法较为简单，即在无菌条件下利用重力离心分离细胞与培养液，但该方法使细胞受到的剪切力较大，对细胞损伤较大，另外，对操作环境要求较高及离心机体积上的限制而无法应用于大规模生产，仅在研究中应用。
2 床层灌注培养
2.1 流化床培养
利用一些诸如磁、电场等技术手段将微载体局限于一定区域内，细胞生长于多孔微载体内部，培养基在流通过程中不会损失细胞，该培养方式适用于贴壁依赖型细胞，具有培养基交换快，细胞养分充足的特点。
2.2 固定床培养
是将微载体固定于无菌容器内，细胞贴附生长在载体上或载体内部，进行培养液更换时，微载体并不移动，可很大程度上降低血清的用量。
2.2.1 中空纤维灌注培养
由于中空纤维培养系统具有类似于生理状态的纤维毛细管模式和灌注式培养基循坏系统, 既有利于高密度细胞在纤维管壁和周围的停留、生长和增殖, 也便于营养物质的供应和代谢产物的转移, 近年来, 已被越来越多地用于杂交瘤细胞的体外培养。
2.2.2 堆积床培养
该方式是将反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。
灌注培养操作的共同优点是：①细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度，一般可达107-109个/ml，从而较大的提高了产量；②连续灌流系统使细胞稳定的处在较好的营养环境中，有害代谢废物积累较低；③反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率；④产品在罐内停留时间短，可及时回收，有利于保持产品的活性。目前应用连续灌流工艺的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。连续灌注培养法是近年来用于哺乳动物细胞培养生产分泌型重组治疗性药物和嵌合抗体，以及人源化抗体等基因工程抗体较为推崇的一种操作方式。
作者简介：吕中华，男，硕士，哈药集团药物研究院