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【摘 要】目的：探討环维黄杨星 D（CVB-D）对大鼠离体胸主动脉环的作用。方法：采用大鼠离体胸主动脉环灌流模型，观察累积浓度CVB-D对盐酸去氧肾上腺素（PE）或氯化钾（KCl）预处理的内皮完整及去内皮主动脉环的作用。结果：累积加入CVB-D 4～64g/ml，对PE或KCl预处理的主动脉环均能产生明显的舒张作用（P<0.01），且其舒张作用随浓度的增高而增强，呈现明显的剂量-效应关系。在64～256g/ml之间其收缩作用逐渐增强（P<0.01）。在CVB-D浓度高于256g/ml时，其舒张作用又随着浓度的增高而增强（P<0.01）。结论：不同浓度的CVB-D对大鼠离体胸主动脉环具有双向调节作用。
【关键词】环维黄杨星D；大鼠；离体胸主动脉环；双向作用
环维黄杨星D（CVB-D）是从黄杨科植物小叶黄杨及其同属植物中提取分离得到的一种生物碱， 商品名为黄杨宁，亦称环常绿黄杨碱D、黄杨碱等，它对心血管系统有重要的作用，具有强心、抗心绞痛、扩张血管、抗心律失常等作用[1]。目前对CVB-D的药理作用已进行了广泛的研究，而CVB-D对大鼠离体胸主动脉环的双向作用国内未见报道。本文旨在观察CVB-D对大鼠离体胸主动脉环的药理作用，以期为该药物的进一步临床应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品与试剂
盐酸去氧肾上腺素注射液：上海禾丰制药有限公司，批号20060908；环维黄杨星D：河南开封开抗药业有限公司，批号200501018；其它试剂均为国产分析纯。
1.1.2 实验仪器
HV-4离体组织器官恒温灌流系统、HW-1000超级恒温水浴及BL-410生物机能实验系统：成都泰盟科技有限公司；JH-2张力换能器：北京航天医学工程研究所。
1.1.3 实验动物
健康雄性Wistar大鼠，150～180g。由中国医学科学院放射医学研究所动物中心提供，动物合格证号：SCXK（京）2005-001。
1.2 方法
1.2.1 大鼠离体胸主动脉环制备
取健康雄性Wistar大鼠，脱颈椎处死后，立即打开胸腔，迅速取出胸主动脉，小心分离附着的脂肪及结缔组织后，用剪刀剪成宽3mm的主动脉环。去内皮主动脉环的制备采用机械法。用2个不锈钢丝制成的三角支撑架穿过主动脉环，其中一只挂在浴槽内的固定钩上，另一只用细线与张力换能器连接固定，用BL-410生物机能实验系统记录主动脉平滑肌张力的变化。将主动脉环完全浸入37℃恒温的K-H液中，浴槽内持续通以95%O2和5%CO2的混合气体，稳定过程先以0g张力开始，维持15min后调节其基础张力至2g，平衡1.5h，期间每隔15min更换一次新鲜的37℃恒温的K-H液。
用PE 10-6mol/L收缩主动脉环达峰值后，加入ACh 10-5mol/L以检验主动脉内皮的完整性。若加ACh后使PE预处理的主动脉环舒张80%以上，可认为内皮完整；若加ACh后使PE预处理的主动脉环不舒张或舒张10%以下，则认为内皮去除[2]。
以PE 10-6mol/L或KC1 60mmo1/L诱发的最大收缩幅度为100%，以加入药物后的血管张力幅度与PE或KCI诱发最大收缩幅度之间的比率做血管舒张反应的量-效曲线。
1.2.2 CVB-D对主动脉环的作用
以PE 10-6mol/L或KC1 60mmo1/L预收缩主动脉环达最大效应后，累加CVB-D （终浓度分别为4，8，16，32，64，128，256，512g/ml），每10min加入1次，观察其对内皮完整及去内皮主动脉环张力的影响；对照组以K-H液代替CVB-D等容加入；乙酸组：以乙酸/K-H液代替CVB-D等容加入。
1.2.3 统计学方法
结果以均数 标准差（ s）表示，以SPSS15.0统计软件进行统计分析，多组间均数的比较采用单因素方差分析，P <0.05表示有统计学差异。
2 结果
2.1 CVB-D对基础状态内皮完整动脉环张力的影响
在内皮完整的主动脉环中，累积给予CVB-D2～256 g/ml，与对照组比较，P均>0.05，各浓度CVB-D对正常主动脉环张力均无明显影响（见图1）。
图1 CVB-D对基础状态内皮完整主动脉环张力的影响（ ±s，n =8）
2.2 CVB-D对PE预处理的内皮完整及去内皮的主动脉环张力的影响
在PE预处理的内皮完整及去内皮的主动脉环，累积加入CVB-D 4～64g/ml，均能产生明显的舒张作用（P<0.01），且其舒张作用随浓度的增高而增强，呈现明显的剂量-效应关系。在64～256g/ml之间其收缩作用逐渐增强（P<0.01），在256g/ml时达最大收缩。在浓度高于256g/ml时，其舒张作用又随着浓度的增高而增强（P<0.01）。而乙酸组与对照组比较无显著性差异（P>0.05）（见图2，图3）。在CVB-D 64，128，256g/ml时，内皮完整组与去内皮组比较均有显著性差异（P<0.05和 P<0.01）（见图4）。
2.3 CVB-D对KCl预处理的内皮完整及去内皮的主动脉环张力的影响
在KCl预处理的内皮完整的主动脉环，累积加入CVB-D 4～64g/ml，均能产生明显的舒张作用（P<0.01）；且其舒张作用随浓度的增高而增强。在64～256g/ml之间其收缩作用逐渐增强（P<0.01），在256g/ml时达最大收缩；在浓度高于256g/ml时，其舒张作用又随着浓度的增高而增强（P<0.01）（见图5）。
在KCl预处理的去内皮的主动脉环，累积加入CVB-D 8～32g/ml，均能产生明显的舒张作用（P<0.01），且其舒张作用随浓度的增高而增强；在32～128g/ml之间其收缩作用逐渐增强（P<0.01），在128g/ml时达最大收缩；在浓度高于128g/ml时，其舒张作用又随着浓度的增高而增强（P<0.01）（见图6）。 在CVB-D 64，128g/ml时，内皮完整组与去内皮组比较均有显著性差异（P<0.05和 P<0.01）（见图7）。
3 讨论
血管平滑肌细胞的收缩与细胞内Ca2+浓度密切相关。细胞内Ca2+源于外Ca2+内流和内Ca2+释放。细胞外Ca2+内流主要通过受体门控性钙通道（ROCC）和电压依赖性钙通道（VDCC）以及静息时的Ca2+内流完成；而细胞内的Ca2+释放主要来自肌浆网。血管平滑肌细胞肌浆网内Ca2+释放途径主要有两条：一是通过IP3受体，另外是通过ryanodine受體。当这些受体被激活开放时，就可导致Ca2+从肌浆网内释放出来，从而升高细胞内Ca2+浓度，引起主动脉环的收缩[3]。
高钾主要引起平滑肌细胞去极化，激活细胞膜上的VDCC，引起细胞外Ca2+的内流也诱导了细胞内ryanodine敏感钙池的释放，即所谓的钙诱导的钙释放（CICR），升高细胞内钙，增强收缩[4]。PE则主要是通过作用于α1肾上腺素受体，激活了磷脂酶C，产生三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG），从而诱导了细胞内的另一种钙池IP3敏感钙池的钙释放，PE也可通过激活细胞膜上的ROCC增强外钙内流[5]。
本实验在观察CVB-D对大鼠离体胸主动脉环的作用时发现，其对内皮完整的正常主动脉环张力无影响。但在CVB-D 4～64g/ml时对PE或KCl预处理的内皮完整的或去除内皮的主动脉环都具有明显的浓度依赖性舒张作用，提示CVB-D可能抑制了高钾和PE引起的胞外钙内流或是抑制了细胞内两种不同钙池的钙释放，而起到舒张主动脉血管的作用。而CVB-D 在64～128g/ml时对主动脉血管平滑肌的收缩作用机制还有待进一步研究。
参考文献：
[1] 谭峰，顾卫，吴海科.环维黄杨星D的临床与实验研究近况[J].中国中医急症，2005，14（7）：683-684.
[2] 林杨闯，胡申江，徐丹蕾，等.苦碟子水提取液对大鼠离体胸主动脉环的舒张作用[J].中国药理学与毒理学杂志.2007，6，21（3）：202-206.
[3] Junzhi Ji，Christina G，Benishin，et al.Nitric oxide selectively inhibits intracellular Ca2+ release elicited by inositol triphosphate but not caffeine in rat vascular smooth muscle[J].J Pharmacol Exp Ther，1998，285（1）：16-21.
[4] C Zhang，XH Wang，MF Zhong，et al.Mechanisms underlying vasorelaxant action of astragaloside IV in isolated rat aortic rings[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2007， 34（5-6）：387-92.
[5] Il-Woo Shin， Ju-Tae Sohn and Hee-Jin Kim，et al. Etomidate attenuates phenylephrine-induced con?traction in isolated rat aorta[J].CAN J ANESTH 2005，52（9）：927-934.
【关键词】环维黄杨星D；大鼠；离体胸主动脉环；双向作用
环维黄杨星D（CVB-D）是从黄杨科植物小叶黄杨及其同属植物中提取分离得到的一种生物碱， 商品名为黄杨宁，亦称环常绿黄杨碱D、黄杨碱等，它对心血管系统有重要的作用，具有强心、抗心绞痛、扩张血管、抗心律失常等作用[1]。目前对CVB-D的药理作用已进行了广泛的研究，而CVB-D对大鼠离体胸主动脉环的双向作用国内未见报道。本文旨在观察CVB-D对大鼠离体胸主动脉环的药理作用，以期为该药物的进一步临床应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品与试剂
盐酸去氧肾上腺素注射液：上海禾丰制药有限公司，批号20060908；环维黄杨星D：河南开封开抗药业有限公司，批号200501018；其它试剂均为国产分析纯。
1.1.2 实验仪器
HV-4离体组织器官恒温灌流系统、HW-1000超级恒温水浴及BL-410生物机能实验系统：成都泰盟科技有限公司；JH-2张力换能器：北京航天医学工程研究所。
1.1.3 实验动物
健康雄性Wistar大鼠，150～180g。由中国医学科学院放射医学研究所动物中心提供，动物合格证号：SCXK（京）2005-001。
1.2 方法
1.2.1 大鼠离体胸主动脉环制备
取健康雄性Wistar大鼠，脱颈椎处死后，立即打开胸腔，迅速取出胸主动脉，小心分离附着的脂肪及结缔组织后，用剪刀剪成宽3mm的主动脉环。去内皮主动脉环的制备采用机械法。用2个不锈钢丝制成的三角支撑架穿过主动脉环，其中一只挂在浴槽内的固定钩上，另一只用细线与张力换能器连接固定，用BL-410生物机能实验系统记录主动脉平滑肌张力的变化。将主动脉环完全浸入37℃恒温的K-H液中，浴槽内持续通以95%O2和5%CO2的混合气体，稳定过程先以0g张力开始，维持15min后调节其基础张力至2g，平衡1.5h，期间每隔15min更换一次新鲜的37℃恒温的K-H液。
用PE 10-6mol/L收缩主动脉环达峰值后，加入ACh 10-5mol/L以检验主动脉内皮的完整性。若加ACh后使PE预处理的主动脉环舒张80%以上，可认为内皮完整；若加ACh后使PE预处理的主动脉环不舒张或舒张10%以下，则认为内皮去除[2]。
以PE 10-6mol/L或KC1 60mmo1/L诱发的最大收缩幅度为100%，以加入药物后的血管张力幅度与PE或KCI诱发最大收缩幅度之间的比率做血管舒张反应的量-效曲线。
1.2.2 CVB-D对主动脉环的作用
以PE 10-6mol/L或KC1 60mmo1/L预收缩主动脉环达最大效应后，累加CVB-D （终浓度分别为4，8，16，32，64，128，256，512g/ml），每10min加入1次，观察其对内皮完整及去内皮主动脉环张力的影响；对照组以K-H液代替CVB-D等容加入；乙酸组：以乙酸/K-H液代替CVB-D等容加入。
1.2.3 统计学方法
结果以均数 标准差（ s）表示，以SPSS15.0统计软件进行统计分析，多组间均数的比较采用单因素方差分析，P <0.05表示有统计学差异。
2 结果
2.1 CVB-D对基础状态内皮完整动脉环张力的影响
在内皮完整的主动脉环中，累积给予CVB-D2～256 g/ml，与对照组比较，P均>0.05，各浓度CVB-D对正常主动脉环张力均无明显影响（见图1）。
图1 CVB-D对基础状态内皮完整主动脉环张力的影响（ ±s，n =8）
2.2 CVB-D对PE预处理的内皮完整及去内皮的主动脉环张力的影响
在PE预处理的内皮完整及去内皮的主动脉环，累积加入CVB-D 4～64g/ml，均能产生明显的舒张作用（P<0.01），且其舒张作用随浓度的增高而增强，呈现明显的剂量-效应关系。在64～256g/ml之间其收缩作用逐渐增强（P<0.01），在256g/ml时达最大收缩。在浓度高于256g/ml时，其舒张作用又随着浓度的增高而增强（P<0.01）。而乙酸组与对照组比较无显著性差异（P>0.05）（见图2，图3）。在CVB-D 64，128，256g/ml时，内皮完整组与去内皮组比较均有显著性差异（P<0.05和 P<0.01）（见图4）。
2.3 CVB-D对KCl预处理的内皮完整及去内皮的主动脉环张力的影响
在KCl预处理的内皮完整的主动脉环，累积加入CVB-D 4～64g/ml，均能产生明显的舒张作用（P<0.01）；且其舒张作用随浓度的增高而增强。在64～256g/ml之间其收缩作用逐渐增强（P<0.01），在256g/ml时达最大收缩；在浓度高于256g/ml时，其舒张作用又随着浓度的增高而增强（P<0.01）（见图5）。
在KCl预处理的去内皮的主动脉环，累积加入CVB-D 8～32g/ml，均能产生明显的舒张作用（P<0.01），且其舒张作用随浓度的增高而增强；在32～128g/ml之间其收缩作用逐渐增强（P<0.01），在128g/ml时达最大收缩；在浓度高于128g/ml时，其舒张作用又随着浓度的增高而增强（P<0.01）（见图6）。 在CVB-D 64，128g/ml时，内皮完整组与去内皮组比较均有显著性差异（P<0.05和 P<0.01）（见图7）。
3 讨论
血管平滑肌细胞的收缩与细胞内Ca2+浓度密切相关。细胞内Ca2+源于外Ca2+内流和内Ca2+释放。细胞外Ca2+内流主要通过受体门控性钙通道（ROCC）和电压依赖性钙通道（VDCC）以及静息时的Ca2+内流完成；而细胞内的Ca2+释放主要来自肌浆网。血管平滑肌细胞肌浆网内Ca2+释放途径主要有两条：一是通过IP3受体，另外是通过ryanodine受體。当这些受体被激活开放时，就可导致Ca2+从肌浆网内释放出来，从而升高细胞内Ca2+浓度，引起主动脉环的收缩[3]。
高钾主要引起平滑肌细胞去极化，激活细胞膜上的VDCC，引起细胞外Ca2+的内流也诱导了细胞内ryanodine敏感钙池的释放，即所谓的钙诱导的钙释放（CICR），升高细胞内钙，增强收缩[4]。PE则主要是通过作用于α1肾上腺素受体，激活了磷脂酶C，产生三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG），从而诱导了细胞内的另一种钙池IP3敏感钙池的钙释放，PE也可通过激活细胞膜上的ROCC增强外钙内流[5]。
本实验在观察CVB-D对大鼠离体胸主动脉环的作用时发现，其对内皮完整的正常主动脉环张力无影响。但在CVB-D 4～64g/ml时对PE或KCl预处理的内皮完整的或去除内皮的主动脉环都具有明显的浓度依赖性舒张作用，提示CVB-D可能抑制了高钾和PE引起的胞外钙内流或是抑制了细胞内两种不同钙池的钙释放，而起到舒张主动脉血管的作用。而CVB-D 在64～128g/ml时对主动脉血管平滑肌的收缩作用机制还有待进一步研究。
参考文献：
[1] 谭峰，顾卫，吴海科.环维黄杨星D的临床与实验研究近况[J].中国中医急症，2005，14（7）：683-684.
[2] 林杨闯，胡申江，徐丹蕾，等.苦碟子水提取液对大鼠离体胸主动脉环的舒张作用[J].中国药理学与毒理学杂志.2007，6，21（3）：202-206.
[3] Junzhi Ji，Christina G，Benishin，et al.Nitric oxide selectively inhibits intracellular Ca2+ release elicited by inositol triphosphate but not caffeine in rat vascular smooth muscle[J].J Pharmacol Exp Ther，1998，285（1）：16-21.
[4] C Zhang，XH Wang，MF Zhong，et al.Mechanisms underlying vasorelaxant action of astragaloside IV in isolated rat aortic rings[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2007， 34（5-6）：387-92.
[5] Il-Woo Shin， Ju-Tae Sohn and Hee-Jin Kim，et al. Etomidate attenuates phenylephrine-induced con?traction in isolated rat aorta[J].CAN J ANESTH 2005，52（9）：927-934.