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摘要：目的：应用分子生物学技术RT-PCR检测手足口病病原体EV71和CoxA16，为手足口病的治疗和预防提供可靠的依据。
方法：收集2010年7月至2012年6月期间我院收治的手足口病患儿咽拭子、大便标本各110份，疱疹液标本98份，应用RT-PCR技术对病原体EV71和CoxA16监测分析。
结果：110例患者均检出EV71病毒，阳性率100.0%；咽拭子、大便及疱疹液标本中EV71检出率分别为96.4%、92.7%和100.0%。CoxA16的检出率分别为：咽拭子16.4%、大便19.1%、疱疹液19.4%；不同标本对于EV71和CoxA16的检出率无显著性差异（P>0.05；P>0.05）。
结论：RT-PCR检测手足口病毒时间短、敏感性高、特异性高，可作为临床诊断手足口病的有效依据。
关键词：手足口病 EV71 CoxA16 RT-PCR
【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）04-0366-02
手足口病（Hand-foot-mouth disease）是世界范围流行的儿童常见疾病，由肠道病毒（Enter virus 71，EV71）和科萨奇病毒（Cox saekievirus A，CoxA16）感染最为常见。以往临床上对于HFMD的诊断主要借助于细胞分离病毒或特异性血清中和等实验结果，然而这两种检测方法均需要1～2周，很容易延误病情。本文采用RT-PCR检测技术对110例患儿分泌物中EV71和CoxA16进行检测，报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究资料。2010年7月至2012年6月我院隔离病房110例手足口患儿，均符合卫生部《手足口病预防指南》诊断标准。其中男25例，女85例，年龄2个月至12岁，平均年龄（2.5±1.8）岁。患者均以突然发热或持续性高热不退前来就诊，手、足部及口腔出现皮疹98例。就诊时，患者出现乏力、疲倦，部分患者出现抽搐、肢体抖动等症状；49例患儿实验室检查显示外周白细胞计数不同程度增高；19例X线显示肺部纹理增多。
1.2 仪器与试剂。RT-PCR检测仪器采用罗氏480；采用上海之江生物科技有限公司提供的EV71和CoxA16检测试剂盒对标本RNA进行RT-PCR检测，具体操作遵循试剂盒说明书进行。
1.3 检测方法。
1.3.1 标本的收集。采集患儿咽拭子、大便各110份，疱疹液标本98份，送至我院中心实验室进行检测。标本后立即存放于-20℃环境保存。
1.3.2 病毒RNA提取。取标本2g，加入无菌生理盐水1ml重悬。取100ul标本放置于1.5灭菌离心管内，添加Trizol试剂200ul、氯仿100ul，振荡器强力振荡20秒后静置3min，之后12000rpm离心处理2min。取上层无色液体，注意与中间层絮状物的区分，将液体转移至新灭菌的0.5ml离心管内，加入10ulRNA提取液A充分震荡摇匀，8000rpm离心处理1min，去除管内液体成分，之后加入400Ul75%乙醇振荡摇匀，8000rpm离心处理1min，抽干液体成分，如有剩余液体可采用枪头引流，避免触及沉淀颗粒。将装有沉淀物质的离心管置于60℃烘烤箱内干燥5min，加入30ulDepc处理的消毒蒸馏水，移液器充分重悬，静置1min后8000rmp离心处理1min。
1.3.3 RT-PCR反应。罗氏480PCR仪对标本进行PCR扩增，按照说明书进行混合液的配置，调整循环参数，同时设置阳性梯度模板和阴性对照。结果的判定严格遵照罗氏480仪器操作说明书进行。
1.4 统计学处理。采用SPSS15.0软件进行数据统计学处理，计量资料采用X2检验。
2 结果
2.1 EV71和CoxA16检出情况。110例患者均进行EV71和CoxA16病毒检测。EV71检测结果：咽拭子标本110份，检出EV71106份，检出率96.4%；大便标本110份，检出EV71 102份，检出率92.7%；疱疹液标本98份，检出EV7198份，检出率100.0%。
CoxA16检测结果：咽拭子标本25份检出CoxA16，检出率22.7%；大便标本16份检出CoxA16，检出率14.5%；疱疹液标本19份检出CoxA16，检出率19.4%。见表1。
2.2 重症病例EV71和CoxA16感染情况。本组重症病例35例，均检出肠道病毒EV71，其中18例患者疱疹液标本CoxA16阴性，11例大便标本CoxA16阴性，15例咽拭子标本CoxA16阴性。提示，我院手足口重症患者的病原菌以EV71为主，CoxA16可能与重症感染有关，有待进一步研究。
2.3 不同病原患儿的临床特征和辅助检查结果对比。本组EV71病毒核酸阳性18例，CoxA16核酸阳性5例。两者年龄分别为1.0～5.0岁，和1.0～6岁；皮疹发病率为98.0%和96.0%；口腔黏膜病变82%和75%。血常规检测显示白细胞总数增多的49例患者中，32例为EV71病毒阳性，其余为17例为CoxA16病毒阳性；胸部X线检查显示肺部纹理增多19例，其中EV71阳性10例，CoxA16阳性9例。以上不同病源组患儿各项指标比较均无统计学差异（P>0.05）。
3 讨论
HFMD具有较强的传染性，短期内造成大规模的流行爆发。我国HFMD首见于上海，最严重的一次大流行是1998年的台湾省，因肠道病毒EV71感染引起，患病人数十万之多，78例死亡。流行病学调查显示，近10年世界各国和地区，尤其是亚太地区曾多次发生大规模手足口病流行。2008年春季，我国安徽省发生了肠道病毒EV71感染所致的手足口病爆发流行，造成20多名婴儿死亡，同年5月2日，卫生部将HFMD纳入丙类传染病的行列。2008年至2009年我国手足口病488955例和1155525例，发病率从37.01/10万上升至87.01/10万。重症患者从1165例上升至13810例，死亡人数也从126例上升至353例。HFMD流行期间，幼儿园、托儿所等儿童聚集场所容易发生机体感染，家庭内也可能发生聚集发病的现象。手足口病可通过直粪-口途径传播，接触过感染者鼻、咽喉泌物或粪便的人均有可能感染。因EV71病毒大多呈现为隐性，绝大多数患者并无明显症状。而EV71显性的患者则起病较急，直接进入HFMD疱疹性咽峡炎阶段，在口腔、足部、手部出现皮疹，第7d即可进入恢复期，部分患者并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性迟缓性麻痹或心肌炎等，严重时可致死亡。 HFMD的诊断可参照患儿临床体征、流行病学相关资料，最终确诊需要依据实验室检验结果，包括对病毒的分离、血清学实验和病原体核酸检测等。一直以来，病毒分离都是手足口病病原体鉴别的黄金标准，但因其观察时间至少为1周，检测时间太长，容易延误病情，因此一般不推荐应用。血清实验需取发病早期、恢复期双份血清检测才有价值，不但耗时较长且容易受到抗原漂移和其他病原体的干扰，检测结果说服力并不是很强。RT-PCR是一中新型核酸测定技术，具有快速、简便容易操作的优势，具有较高的灵敏性和特异性。近年来，临床上提倡采用病原体核酸检测进行手足口病实验室检验。
EV71较CoxA16病毒更容易诱发中枢神经系统的并发症，出现致死性脑疾病、脑出血或心肌炎。然而，EV71病毒在不同时间、不同区域内感染所致的临床体征并无明显特征，患者临床症状与CoxA16病毒引起者很难区分。临床检验表明，CoxA16的感染往往伴随着EV71的流行。本组110例患者中，咽喉拭子检测EV71阳性率92.7%，大便EV71阳性96.4%，98份（100.0%）疱疹液均为EV71阳性。咽喉拭子及大便标本检测有效率高，只要注意采集部位额采集时间，都可作为手足口病检测的理想标本。疱疹液检测虽有效，但并不是所有患者都会出现疱疹，因此建议将拭子和大便标本作为检测的最常用标准。本组咽喉拭子检测CoxA16阳性16.4%，大便标本阳性16.1%，疱疹液阳性19.4%。由此可知，仅有不到20.0%的患者会感染CoxA16病毒，CoxA16检测在疾病诊断中的价值有待研究。
综上所述，RT-PCR检测法早期检出手足口病病原，可为临床诊断提供可靠的依据，对于小儿手足口病的预防意义重大。
参考文献
[1] 许玉玲，黄学勇，卫海燕，陈豪敏，许汴利.实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测手足口病病原体的比较分析[J].中国病原生物学杂志，2011，（10）：736～738
[2] 唐彦，侯俊，徐军等.实时荧光PCR检测手足口病病原体方法的建立及初步应用[J].中华实验和临床病毒学杂志，2011，（25）：152
[3] 唐宝晖，黄丽华，吴林洪，韦晓仙.实时荧光RT-PCR快速检测手足口病病原体结果分析[J].职业与健康.2012，28（13）：1579～1582
[4] 黄学勇，刘国华，陈豪敏等.河南省肠道病毒71型（EV71）血清流行病学调查[J].中国病原生物学杂志，2010，5（8）：617-618，639
方法：收集2010年7月至2012年6月期间我院收治的手足口病患儿咽拭子、大便标本各110份，疱疹液标本98份，应用RT-PCR技术对病原体EV71和CoxA16监测分析。
结果：110例患者均检出EV71病毒，阳性率100.0%；咽拭子、大便及疱疹液标本中EV71检出率分别为96.4%、92.7%和100.0%。CoxA16的检出率分别为：咽拭子16.4%、大便19.1%、疱疹液19.4%；不同标本对于EV71和CoxA16的检出率无显著性差异（P>0.05；P>0.05）。
结论：RT-PCR检测手足口病毒时间短、敏感性高、特异性高，可作为临床诊断手足口病的有效依据。
关键词：手足口病 EV71 CoxA16 RT-PCR
【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）04-0366-02
手足口病（Hand-foot-mouth disease）是世界范围流行的儿童常见疾病，由肠道病毒（Enter virus 71，EV71）和科萨奇病毒（Cox saekievirus A，CoxA16）感染最为常见。以往临床上对于HFMD的诊断主要借助于细胞分离病毒或特异性血清中和等实验结果，然而这两种检测方法均需要1～2周，很容易延误病情。本文采用RT-PCR检测技术对110例患儿分泌物中EV71和CoxA16进行检测，报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究资料。2010年7月至2012年6月我院隔离病房110例手足口患儿，均符合卫生部《手足口病预防指南》诊断标准。其中男25例，女85例，年龄2个月至12岁，平均年龄（2.5±1.8）岁。患者均以突然发热或持续性高热不退前来就诊，手、足部及口腔出现皮疹98例。就诊时，患者出现乏力、疲倦，部分患者出现抽搐、肢体抖动等症状；49例患儿实验室检查显示外周白细胞计数不同程度增高；19例X线显示肺部纹理增多。
1.2 仪器与试剂。RT-PCR检测仪器采用罗氏480；采用上海之江生物科技有限公司提供的EV71和CoxA16检测试剂盒对标本RNA进行RT-PCR检测，具体操作遵循试剂盒说明书进行。
1.3 检测方法。
1.3.1 标本的收集。采集患儿咽拭子、大便各110份，疱疹液标本98份，送至我院中心实验室进行检测。标本后立即存放于-20℃环境保存。
1.3.2 病毒RNA提取。取标本2g，加入无菌生理盐水1ml重悬。取100ul标本放置于1.5灭菌离心管内，添加Trizol试剂200ul、氯仿100ul，振荡器强力振荡20秒后静置3min，之后12000rpm离心处理2min。取上层无色液体，注意与中间层絮状物的区分，将液体转移至新灭菌的0.5ml离心管内，加入10ulRNA提取液A充分震荡摇匀，8000rpm离心处理1min，去除管内液体成分，之后加入400Ul75%乙醇振荡摇匀，8000rpm离心处理1min，抽干液体成分，如有剩余液体可采用枪头引流，避免触及沉淀颗粒。将装有沉淀物质的离心管置于60℃烘烤箱内干燥5min，加入30ulDepc处理的消毒蒸馏水，移液器充分重悬，静置1min后8000rmp离心处理1min。
1.3.3 RT-PCR反应。罗氏480PCR仪对标本进行PCR扩增，按照说明书进行混合液的配置，调整循环参数，同时设置阳性梯度模板和阴性对照。结果的判定严格遵照罗氏480仪器操作说明书进行。
1.4 统计学处理。采用SPSS15.0软件进行数据统计学处理，计量资料采用X2检验。
2 结果
2.1 EV71和CoxA16检出情况。110例患者均进行EV71和CoxA16病毒检测。EV71检测结果：咽拭子标本110份，检出EV71106份，检出率96.4%；大便标本110份，检出EV71 102份，检出率92.7%；疱疹液标本98份，检出EV7198份，检出率100.0%。
CoxA16检测结果：咽拭子标本25份检出CoxA16，检出率22.7%；大便标本16份检出CoxA16，检出率14.5%；疱疹液标本19份检出CoxA16，检出率19.4%。见表1。
2.2 重症病例EV71和CoxA16感染情况。本组重症病例35例，均检出肠道病毒EV71，其中18例患者疱疹液标本CoxA16阴性，11例大便标本CoxA16阴性，15例咽拭子标本CoxA16阴性。提示，我院手足口重症患者的病原菌以EV71为主，CoxA16可能与重症感染有关，有待进一步研究。
2.3 不同病原患儿的临床特征和辅助检查结果对比。本组EV71病毒核酸阳性18例，CoxA16核酸阳性5例。两者年龄分别为1.0～5.0岁，和1.0～6岁；皮疹发病率为98.0%和96.0%；口腔黏膜病变82%和75%。血常规检测显示白细胞总数增多的49例患者中，32例为EV71病毒阳性，其余为17例为CoxA16病毒阳性；胸部X线检查显示肺部纹理增多19例，其中EV71阳性10例，CoxA16阳性9例。以上不同病源组患儿各项指标比较均无统计学差异（P>0.05）。
3 讨论
HFMD具有较强的传染性，短期内造成大规模的流行爆发。我国HFMD首见于上海，最严重的一次大流行是1998年的台湾省，因肠道病毒EV71感染引起，患病人数十万之多，78例死亡。流行病学调查显示，近10年世界各国和地区，尤其是亚太地区曾多次发生大规模手足口病流行。2008年春季，我国安徽省发生了肠道病毒EV71感染所致的手足口病爆发流行，造成20多名婴儿死亡，同年5月2日，卫生部将HFMD纳入丙类传染病的行列。2008年至2009年我国手足口病488955例和1155525例，发病率从37.01/10万上升至87.01/10万。重症患者从1165例上升至13810例，死亡人数也从126例上升至353例。HFMD流行期间，幼儿园、托儿所等儿童聚集场所容易发生机体感染，家庭内也可能发生聚集发病的现象。手足口病可通过直粪-口途径传播，接触过感染者鼻、咽喉泌物或粪便的人均有可能感染。因EV71病毒大多呈现为隐性，绝大多数患者并无明显症状。而EV71显性的患者则起病较急，直接进入HFMD疱疹性咽峡炎阶段，在口腔、足部、手部出现皮疹，第7d即可进入恢复期，部分患者并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性迟缓性麻痹或心肌炎等，严重时可致死亡。 HFMD的诊断可参照患儿临床体征、流行病学相关资料，最终确诊需要依据实验室检验结果，包括对病毒的分离、血清学实验和病原体核酸检测等。一直以来，病毒分离都是手足口病病原体鉴别的黄金标准，但因其观察时间至少为1周，检测时间太长，容易延误病情，因此一般不推荐应用。血清实验需取发病早期、恢复期双份血清检测才有价值，不但耗时较长且容易受到抗原漂移和其他病原体的干扰，检测结果说服力并不是很强。RT-PCR是一中新型核酸测定技术，具有快速、简便容易操作的优势，具有较高的灵敏性和特异性。近年来，临床上提倡采用病原体核酸检测进行手足口病实验室检验。
EV71较CoxA16病毒更容易诱发中枢神经系统的并发症，出现致死性脑疾病、脑出血或心肌炎。然而，EV71病毒在不同时间、不同区域内感染所致的临床体征并无明显特征，患者临床症状与CoxA16病毒引起者很难区分。临床检验表明，CoxA16的感染往往伴随着EV71的流行。本组110例患者中，咽喉拭子检测EV71阳性率92.7%，大便EV71阳性96.4%，98份（100.0%）疱疹液均为EV71阳性。咽喉拭子及大便标本检测有效率高，只要注意采集部位额采集时间，都可作为手足口病检测的理想标本。疱疹液检测虽有效，但并不是所有患者都会出现疱疹，因此建议将拭子和大便标本作为检测的最常用标准。本组咽喉拭子检测CoxA16阳性16.4%，大便标本阳性16.1%，疱疹液阳性19.4%。由此可知，仅有不到20.0%的患者会感染CoxA16病毒，CoxA16检测在疾病诊断中的价值有待研究。
综上所述，RT-PCR检测法早期检出手足口病病原，可为临床诊断提供可靠的依据，对于小儿手足口病的预防意义重大。
参考文献
[1] 许玉玲，黄学勇，卫海燕，陈豪敏，许汴利.实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测手足口病病原体的比较分析[J].中国病原生物学杂志，2011，（10）：736～738
[2] 唐彦，侯俊，徐军等.实时荧光PCR检测手足口病病原体方法的建立及初步应用[J].中华实验和临床病毒学杂志，2011，（25）：152
[3] 唐宝晖，黄丽华，吴林洪，韦晓仙.实时荧光RT-PCR快速检测手足口病病原体结果分析[J].职业与健康.2012，28（13）：1579～1582
[4] 黄学勇，刘国华，陈豪敏等.河南省肠道病毒71型（EV71）血清流行病学调查[J].中国病原生物学杂志，2010，5（8）：617-618，639