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目的及意义:构建哺乳动物shRNA表达载体,观察shRNA表达载体在细胞水平和机体水平对HBV抗原表达的抑制作用,为应用RNAi技术治疗乙型肝炎奠定一定的基础。方法:本研究将已构建好的HBV真核表达载体pHBV1.5,通过限制性内切酶,PCR鉴定确认正确后,转染Hela细胞。用RT-PCR检测HBV C mRNA转录;免疫细胞化学检测HBeAg前体的表达;MEIA分别检测培养上清和细胞裂解液中HBsAg和HBeAg的表达水平;明确pHBV1.5在Hela细胞中的表达。采用基因重组方法将体外化学合成靶向HBV preC/C基因的shRNA转录模板的DNA序列克隆到含有人U6启动子的载体pTZU6+1中。通过限制性内切酶,测序对构建的载体进行鉴定确认后,将pHBV1.5与已构建好的shRNA表达载体以不同比例分别共转染Hela细胞,72h后,用半定量PCR和MEIA分别分析shRNA表达载体对HBV C mRNA和HBsAg、HBeAg的抑制情况。再将pHBV1.5以水动力学方法快速(10秒之内)高负荷(2.5ml/只)注射Balb/c小鼠尾静脉,注射后第6天,分别检测小鼠血清中HBsAg、HBeAg的表达水平;同时取小鼠肝脏组织,用RT-PCR检测HBV C mRNA的表达,以确认小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型的建立。最后将pHBV1.5与前面体外实验筛选到的干扰作用最强的一个shRNA表达载体(psiHBV1)同样以水动力学方法快速高负荷地共注射Balb/c小鼠尾静脉,同样于注射后第6天,用半定量PCR和MEIA分析shRNA表达载体对HBV C mRNA和HBsAg,HBeAg的抑制情况。结果:经限制性内切酶,PCR证实已成功构建HBV真核表达载体pHBV1.5,经转染后能