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目的:以人腰椎黄韧带细胞（LFCs）为受试对象,观察肝肾亏虚患者LFCs与非肝肾亏虚患者LFCs并探讨其纤维化相关指标的差别,以及miRNA-21在黄韧带纤维化中的作用机制。方法:1.通过比较植块法和胶原酶消化法体外分离的人腰椎LFCs在爬出时间、细胞存活率、细胞形态学等指标上的差异以选出最优方法,进行后续实验细胞的提取;2.采用免疫荧光法对LFCs进行collagen type Ⅰ、collagen typeⅢ、Vimentin蛋白染色进行观察。3.分别对肝肾亏虚患者与非肝肾亏虚患者的组织块进行原代提取及培养,对其爬出时间、细胞存活率的差异进行比较,倒置显微镜及激光共聚焦显微镜下观察两组细胞基本形态及其细胞骨架的异同;4.流式细胞仪术对两组细胞进行周期及活性氧（ROS）检测;5.Western Blot 检测两组细胞中 TGF-β 1、collagen typeⅠ、collagen typeⅡ、collagen typeⅢ 蛋白的表达情况。6.用 mimic miRNA-21、NCmimic miRNA-21、inhibitor miRNA-21 与 NC inhibitor miRNA-21 对肝肾亏虚患者LFCs进行转染干预,以RT-qPCR法检测其miRNA-21的表达量,检测转染是否完成。7.WeStern Blot法对三组,即空白对照组（此空白对照组LFCs为肝肾亏虚患者组织块所培养）、inhibitor miRNA-21组及mimic miRNA-21组中总蛋白检测其纤维化相关蛋白collagen type Ⅰ、collagen typeⅡ、collagen typeⅢ 以及 TGF-β1/Smad 信号通路相关蛋白TGF-β1、Smad 1、Smad2、Smad7 的表达情况。结果:1.植块法与胶原酶消化法（四种组合方式）从爬出时间方面对比,胶原酶消化法（四种组合方式）均优于植块法,差异有统计学意义（P＞0.05）,从细胞存活率方面看,植块法与胶原酶消化法（四种组合方式）对比,差异无统计学意义。综合上述结果,表明可以选胶原酶消化法其中任意一种组合方式提取LFCs进行后续实验。倒置显微镜观察LFCs最初贴壁分散生长,发现当出现70%以上融合率时细胞多呈漩涡方向生长,呈梭形和多边形细胞。2.免疫荧光染色 collagen type Ⅰ、collagen typeⅢ 及 Vimentin 蛋白呈阳性,结果说明通过原代提取培养的细胞其表面抗原特性符合LFCs抗原特性,所提取细胞可以用于后续实验。3.肝肾亏虚患者与非肝肾亏虚患者LFCs爬出时间之间差异无统计学意义（P＞0.05）,细胞存活率无显著差异（P＞0.05）。光镜下观察两组细胞均呈梭型或长梭形,扇形或者不规则的三角形或多角形,细胞核呈规则的卵圆形,数量较多,无明显区别。激光共聚焦显微镜下观察,肝肾亏虚组与非肝肾亏虚组细胞核均呈椭圆形且着色均匀,大小较平均。肝肾亏虚组细胞骨架染色显示:骨架纤维感强,构建成一个中央α螺旋杆状区,具有张力和抗剪切力。而非肝肾亏虚组细胞骨架多为微丝结果,活动性强,出现少量应力纤维。4.流式检测细胞周期结果如下:G1期肝肾亏虚组细胞比例（81.61%±0.013）高于非肝肾亏虚组（66.10%±0.024）,肝肾亏虚组的G2期细胞比例（8.65%±0.006）显著（P＜0.01）低于非肝肾亏虚组的G2期细胞比例（14.76%±0.004）,肝肾亏虚组的S期细胞比例（9.73%±0.007）显著（P＜0.01）低于非肝肾亏虚组的S期细胞比例（19.13%±0.020）。流式检测细胞ROS测定结果如下:肝肾亏虚组ROS水平高于非肝肾亏虚组。结果有统计学意义（P＜0.01）。5.肝肾亏虚组 LFCs 中 TGF-β1、collagen type Ⅰ、collagen typeⅡ、collagen typeⅢ蛋白表达量均高于非肝肾亏虚患者LFCs（P＜0.01）。6.转染后24h内进行QT-PCR法检测各组其miRNA-21的表达量结果为:mimic miRNA-21 组显著高于 NC mimic miRNA-21 组（P＜0.01）,inhibitor miRNA-21 组低于 NC inhibitor miRNA-21组（P＜0.01）,转染成功。7.采用WeStern Blot法对空白对照组、inhibitor miRNA-21组及mimic miRNA-21 组中纤维化相关蛋白 collagen type Ⅰ、collagen typeⅡ、collagen typeⅢ 以及 TGF-β 1/Smad 信号通路相关蛋白 TGF-β 1、Smad 1、Smad2、Smad7蛋白的表达情况进行检测,结果显示:与空白组相比,mimic miRNA-21 组中的 collagen type Ⅰ、collagen typeⅡ、collagen typeⅢ的蛋白含量明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）;而inhibitor miRNA-21组中collagen typeⅡ蛋白含量明显下降,差异有统计学意义（P＜0.01）,collagen type Ⅰ、collagen typeⅢ蛋白含量无明显变化,差异无统计学意义（P＞0.05）;与空白组相比,mimicmiRNA-21组中的TGF-β1的蛋白含量明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）;inhibitor miRNA-21组中TGF-β 1蛋白含量明显下降,差异有统计学意义（P＜0.01）;与空白组相比,mimicmiRNA-21组中的Smad1、Smad2的蛋白含量明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）;inhibitor miRNA-21组中Smad1、Smad2蛋白含量明显下降,差异有统计学意义（P＜0.01）;与空白组相比,mimic miRNA-21组中的Smad7的蛋白含量明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;inhibitormiRNA-21组中Smad7蛋白含量明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论:1.植块法与胶原酶消化法均可成功提取人LFCs,且LFCs存活率均较高,胶原酶预消化法在细胞爬出时间上优于植块法,表明可根据实际情况选择胶原酶消化法中的任意一种组合方式。2.肝肾亏虚患者LFCs中纤维化相关蛋白表达量显著高于非肝肾亏虚患者LFCs,表明肝肾亏虚患者黄韧带的纤维化程度高于非肝肾亏虚组。3.miRNA-21能促进LFCs中纤维化相关蛋白表达。4.miRNA-21促进黄韧带纤维化的作用可能与激活TGF-β 1/Smad信号通路有关。