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研究背景缺血再灌注损伤(Ischemiareperfusioninjury,I/R),指冠状动脉局部或完全急性梗阻后,在一定时间内又再次贯通。缺血的心肌组织虽然得以恢复正常血流,但缺血心肌组织的损伤却呈逐渐加重的病理过程。心肌缺血会引起电生理、能量代谢、心肌超微结构、心功能和钙超载等众多损伤性改变。这些损伤性改变在血流再次贯通后表现得更为剧烈,甚至会导致严重的心律失常而使患者猝死。研究已经证实,氧化应激是导致心肌缺血再灌注损伤的重要原因。Alda-1全称是N-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2,6-二氯苯甲酰胺,是通过高通量筛选的方法筛选出的ALDH2的小分子激活剂,可通过变构激活提高ALDH2的活性,可以使野生型ALDH2的活性增加2倍,使突变型ALDH2的活性增加11倍。大鼠心肌缺血前给药可以减少心脏约60%的梗死面积,改善急性心肌梗死后心室功能和减轻线粒体功能障碍。既往研究表明,Alda-1在动物实验中急性心肌梗死和心肌细胞保护等方面发挥重要的作用,但是其临床应尚无相关研究报道。乙醛脱氢酶2(Acetaldehydedehydrogenase2,ALDH2)定位于线粒体,主要分布在肝脏、心脏、脑等组织中。ALDH2参与酒精代谢途径,催化乙醛转化为乙酸,减轻酒精导致的中毒症状,降低乙醇对多个脏器的伤害。ALDH2具有脱氢酶活性,能够代谢多种醛类物质。激活ALDH2的活性后能够有效的降低由缺血造成的心脑等损伤。急性心肌梗死和心脏骤停是两种临床上常见且危害极大的心血管危重疾病,常造成严重的心肌损伤、心功能障碍甚至死亡。然而,目前针对心肌保护的手段极其匮乏。既往研究已经较为清晰地阐明了乙醛脱氢酶2(ALDH2)激动剂Alda-1对心肌损伤的保护作用及内在机制,本实验在此基础上继续探讨Alda-1的成药性。本实验拟制备临床应用Alda-1注射液,考察其药理作用和药代学特征,并将对Alda-1的成药性进行评价,为继续深入临床前研究或临床药物试验奠定一定研发基础。研究目的1.探索Alda-1的临床应用方式,为Alda-1的临床转化探究可能的途径。2.探讨Alda-1注射液在小鼠心肌缺血再灌注损伤中发挥的作用。研究方法一、体内实验1.建立小鼠缺血再灌注模型选择雄性C57BL/6小鼠60只,分为六组:假手术组(Sham组),缺血再灌注组(I/R 组),I/R+DMSO 组,I/R+DMSO+Alda-1 组,I/R+ALC+PEG+NS 组,I/R+ALC+PEG+NS+Alda-1组。其中Sham组小鼠麻醉开胸后只在挤出心脏后迅速放回,不接扎血管。I/R组小鼠麻醉后,快速开胸,结扎阻断左前降支血流45分钟,然后解开结扎处使血管血流再灌注4小时。I/R+DMSO+Alda-1组鼠:DMSO溶解的Alda-1腹腔注射20mg/kg。I/R+DMSO组小鼠:腹腔注射同等剂量的 DMSO。I/R+ALC+PEG+NS+Alda-1 组小鼠:ALC+PEG+NS 溶解的Alda-1尾静脉注射20mg/kg。I/R+ALC+PEG+NS组小鼠:尾静脉注射同等剂量的 ALC+PEG+NS;2.TTC染色法检测各组小鼠手术后的心肌梗死面积;3.蛋白印迹法(Western blot,WB):各组小鼠在7天后处死留取心脏提取心肌细胞总蛋白,分别检测β-actin,Bax,4-HNE和Bcl-2等蛋白的表达水平;4.小动物心脏超声评价心功能:在M超下检测,并用超声机器自带的计算程序计算短轴缩短率(Fraction shortening,FS)与左室射血分数(Left VentricuLar Ejection Fractions,LVEF);5.家兔血管刺激性实验使用3只健康家兔,左侧耳缘静脉注射Alda-1注射液原液或稀释液,药物的使用量是1 mL/kg,采用自身对照,右侧耳缘静脉注射相同体积的0.9%氯化钠溶液。连续给药3天,每天给药一次。随后采用H&E染色检测家兔耳缘静脉病理状态;二、体外实验1.Alda-1注射液UV-Vis分析方法的建立1.1检测波长的测定精密称取10.0mg Alda-1,将Alda-1加入到10mL规格的容量瓶中,加入乙醇定容,得到1mg/mL的储备液。从Alda-1储备液中吸取40uL,加入乙醇使其浓度稀释至4ug/mL,使其作为Alda-1检测溶液。在200-700nm范围内对Alda-1检测溶液进行紫外扫描,空白对照溶液为乙醇。1.2标准曲线的建立精密量取“1.1”项中的 Alda-1 储备液 10uL、20uL、30uL、40uL、50uL、60uL、70uL分别加入到10mL容量瓶中,用乙醇分别定容至10mL,得到浓度分别为 1ug/mL、2ug/mL、3ug/mL、4ug/mL、5ug/mL、6ug/mL、7ug/mL 的Alda-1标准溶液。于检测波长285nm处检测各Alda-1标准溶液的药物吸收峰,空白对照溶液为乙醇。2.Alda-1注射液Alda-1的溶解度测定和方案选择2.1根据2015版《中国药典》,制定了 2种Alda-1注射液方案(1)溶剂:注射用大豆油、注射用甘油、生理盐水乳化剂:大豆卵磷脂(2)溶剂:乙醇、聚乙二醇400、生理盐水助溶方法:超声波震荡2.2利用HPLC检测Alda-1注射液中Alda-1的溶解度3.注射液溶血性检测3.1制备红细胞混悬取家兔心脏血约20mL,用生理盐水将处理后的红细胞按照所得容积稀释成2%混悬液备用。3.2 Alda-1注射液溶血性实验取洁净离心管,依次加入不同体积的Alda-1注射液原液,每个浓度平行2管,同时设纯化水(阳性对照)、生理盐水(阴性对照)。分别按照要求加好后,轻微震荡混匀,立即将离心管放置于37℃温箱中进行温育。研究结果1.Alda-1注射液的制备1.1 Alda-1的紫外吸收峰在285nm1.2 Alda-1注射液方案选择采用乙醇为主要溶剂,聚乙二醇400和生理盐水为辅助溶剂的制备方案。1.3 Alda-1注射液的Alda-1药物浓度是4.98g/mL精确称量20mgAlda-1,加入洁净的5mL的EP管中,将1mL的乙醇加入EP管中,利用超声波震荡3分钟。加入600uL PEG400和400uL生理盐水,使其混匀。2.Alda-1注射液安全性实验2.1 Alda-1注射液对家兔耳缘静脉无明显的血管刺激性稀释后家兔耳缘静脉静脉注射时偶有血管轻度扩张现象,而针刺部位的近心端静脉未见明显的充血水肿或血栓形成,光镜下病理组织学检查,注射部位血管结构完整,血管内皮细胞无明显变性、坏死,管腔内无血栓形成。2.2 Alda-1注射液无明显的溶血刺激性实验中家兔血制成的2%的红细胞悬液上层液体澄明,未出现肉眼可见的溶血及凝集反应,镜下观察时未见红细胞破裂。3.Alda-1注射液的疗效实验3.1 Alda-1注射液可改善小鼠I/R后心功能3.2 Alda-1注射液可以降低小鼠缺血再灌注损伤导致的心肌梗死TTC染色结果显示,与I/R组相比Alda-1注射液可减少约15%的心肌梗死。3.3 Alda-1注射液可以减少小鼠心肌细胞凋亡相关蛋白的表达Western Blot的检测显示Alda-1注射液尾静脉注射增加凋亡通路保护性蛋白Bcl-2的表达,减少凋亡标志物BAX的表达,所以Alda-1注射液可以减轻心肌细胞凋亡。3.4 Alda-1注射液可以减少小鼠心脏毒性醛类的聚集4.Western Blot的检测显示Alda-1注射液尾静脉注射减少小鼠心脏毒性醛类4-HNE的聚集。研究结论1.选择乙醇为主要溶剂,聚乙二醇400和生理盐水为辅助溶剂的Alda-1注射液具有更好的Alda-1溶解度。2.Alda-1注射液具有较好的安全性,家兔静脉注射时刺激性较小,并且不会造成红细胞溶血。3.Alda-1注射液可以改善小鼠缺血再灌注后的心脏功能,减轻缺血再灌注损伤。