菜粉蝶(Pieris rapae)属鳞翅目粉蝶科,其幼虫是危害十字花科蔬菜的主要害虫之一。当前,针对此虫的防治主要依赖化学农药,如高效氯氟氰菊酯、氯虫苯甲酰胺和阿维菌素等。但化学药剂的长期无节制施用,不仅会加重环境污染,而且会降低害虫对药剂的敏感性,导致防治效果逐渐降低。前人研究发现,杀虫剂可以诱导昆虫机体产生大量活性氧,这会对昆虫造成氧化损伤。而昆虫的抗氧化酶系统能够抵御氧化损伤,从而间接增强害虫对农药的耐受性。目前,关于菜粉蝶抗氧化酶系统的报道非常有限。鉴于此,本研究针对菜粉蝶抗氧化酶系统中两类关键酶——过氧化氢酶(catalase,CAT)和硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase,TPX)展开研究,重点关注这两类酶在菜粉蝶幼虫抵御高效氯氟氰菊酯中的作用。研究结果可从分子水平初步揭示抗氧化酶在菜粉蝶防御外界不适条件中的作用,从而为农业害虫的防控提供理论依据。现将主要研究结果总结如下:1.菜粉蝶CAT和TPX基因的鉴定和生物信息学分析通过检索已公布的菜粉蝶转录组和基因组数据库,鉴定了一个CAT基因(命名为PrCAT)和五个TPX基因(命名为PrTPX1、PrTPX3、PrTPX4、PrTPX5和PrTPX6)。PrCAT编码一个由509个氨基酸组成的蛋白质,而由PrTPX1、3、4、5、6编码的5个蛋白质的氨基酸数量介于189-247之间。PrTPX3蛋白的N端被预测出有一段线粒体转运肽,暗示着该蛋白可能定位于线粒体中;而PrTPX4蛋白的N端预测出一段分泌信号肽,暗示该蛋白可能会被分泌出胞外。BLAST 比对结果显示这些基因均与鳞翅目的直系同源基因具有较高的一致性。系统进化结果也表明PrCAT和PrTPX基因与鳞翅目昆虫直系同源基因的亲缘关系较近,而与其它种类昆虫的直系同源基因亲缘关系较远。2.菜粉蝶CAT和TPX基因的表达模式分析反转录PCR结果表明,PrCAT和PrTPX在菜粉蝶不同组织和发育期中均有表达。实时荧光定量PCR结果显示,PrCAT在不同发育期的相对表达量差异较大,在4龄和5龄期幼虫中的表达量最高,成虫中的表达水平第二,但两者均显著高于2龄、3龄期幼虫以及蛹中的表达量。PrCAT基因的表达水平在脂肪体、马氏管和残体等组织中几乎相同,但均显著低于中肠。5个PrTPX基因表达水平各不相同,总体来看,这5个基因在中肠中的表达量均相对较高,在5龄期幼虫和蛹中的表达水平均相对较低。使用高效氯氟氢菊酯处理菜粉蝶幼虫后,发现试虫体内过氧化氢和丙二醛含量显著升高,同时PrCAT和PrTPX基因的表达量也显著上升,由此推测,菜粉蝶PrCAT和PrTPX基因很可能参与了菜粉蝶幼虫对氧化胁迫的防御。3.菜粉蝶CAT和TPX蛋白的抗氧化性质分析设计基因特异性引物,构建了 PrCAT、PrTPX1、PrTPX4和PrTPX6的原核表达载体,转化大肠杆菌,原核表达重组蛋白并纯化。利用蛋白催化降解H202的特性,检测了这4个重组蛋白的活性。结果表明,PrCAT、PrTPX1、PrTPX4和PrTPX6蛋白均具有清除过氧化氢的活性。进一步利用滤纸片平板扩散法分析了PrTPX1蛋白的抗氧化能力,结果表明,较之于对照组(转化pET30a空载体的大肠杆菌菌株),转化了 pET30a-PrTPX1表达质粒的大肠杆菌菌株对过氧化氢异丙苯(活性氧诱导物)的耐受性更强,证明了 PrTPX1蛋白具有抗氧化能力。