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研究背景:原发性肝癌（primary hepatic carcinoma）,简称肝癌,是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因,其高发病率高致死率俨然已经严重影响人类的健康。鳖甲煎丸作为经典名方,该方疗效明确。在改善肝癌患者临床症状、提高患者生存质量、延长生存时间等多方面具有明显的优势,但是其作用于肝癌的机制尚未完全阐明。近年研究显示,鳖甲煎丸可以抑制肝癌细胞的生长,促进肝癌细胞凋亡,其机制可能与调控Wnt/β-catenin通路有关,具体有待于进一步研究。近年来人们发现了大量的长链非编码RNA（longnon-coding RNA,lnc RNA）可以作为ce RNA竞争性结合下游分子miRNA,激活相关信号通路,调控疾病进展,从而成为揭示疾病相关机制的研究热点。其中LncSNHG5、miR-26a-5p调控Wnt信号通路的重要作用已在EMT研究中得到证实。基于以上研究,本论文进一步验证鳖甲煎丸是否通过LncSNHG5调控miR-26a-5p作用于Wnt信号通路,影响下游β-catenin蛋白的表达,从而发挥抗癌的作用机理。该研究对于阐释鳖甲煎丸治疗肝癌的机制,从而指导临床用药及推广具有重要意义。目的:以裸鼠和hepG2细胞为实验对象,先探讨鳖甲煎丸对裸鼠肝癌模型的影响效果,再验证鳖甲煎丸是否通过LncSNHG5竞争性结合miR-26a-5p作用于Wnt信号通路,影响下游β-catenin蛋白的表达,进而影响肝癌疾病进展。本研究以期进一步阐释鳖甲煎丸治疗肝癌的机制,为临床提供用药依据,并推广该药的临床应用。方法:1.通过细胞移植法建立裸鼠肿瘤模型,利用经典药效学评价鳖甲煎丸对人肝癌hepG2裸鼠移植瘤的影响。具体方法:（1）培养hepg2细胞,选取50只体重约18g的雄性Balb/c裸鼠,通过皮下注射hepg2细胞的方法建立肝癌裸鼠模型。（2）模型评定成功后,按照随机数字表法,把裸鼠随机分为模型组（NC）、鳖甲煎丸低浓度组（BJJW.L0.5g/kg/d）、鳖甲煎丸中浓度组（BJJW.M1.0g/kg/d）、鳖甲煎丸高浓度组（BJJW.H2.0g/kg/d）,索拉非尼组（PC.100mg/kg/d）,按计量连续灌药28天（NC组给予等体积的生理盐水）。给药期间记录各组裸鼠体重和瘤体增长曲线。（3）在第29天处死裸鼠,取裸鼠肿瘤组织进行切片染色,观察各组裸鼠肿瘤切片病理变化。2.LncSNHG5/miR-26a5p及miR-26a-5p/Wnt通路关键蛋白GSK-3β互作关系的验证,具体方法:生物信息学预测LncSNHG5/miR-26a-5p及miR-26a5p/GSK-3β的互作关系,然后使用双荧光素酶报告实验分别验证LncSNHG5/miR-26a-5p,miR-26a-5p/GSK-3β的互作关系。3.研究鳖甲煎丸用通过LncSNHG5/miR-26a-5p/Wnt信号通路对裸鼠肝癌模型的影响,具体方法:（1）采用RT-q PCR方法检测不同组别癌组织中SNHG5、miR-26a-5p、GSK-3β的表达含量;（2）采用蛋白免疫印迹法（western blot,WB）检测不同组别β-catenin、GSK-3β蛋白的表达量。结果:1.建立人肝癌hepG2裸鼠肿瘤模型,通过经典药效学评价鳖甲煎丸对模型的干预效果,结果显示:（1）裸鼠瘤体变化结果:干预组裸鼠肿瘤体积均小于模型组,其中西药组裸鼠瘤体最小,中药组裸鼠瘤体变化呈浓度依赖性（P＜0.05）。（2）裸鼠体重变化结果:西药组体重最低,与模型组相比,鳖甲煎丸干预组无明显差别。（3）裸鼠切片变化结果:模型组肿瘤组织完整,肿瘤细胞体积较大,细胞核大深染、肿瘤细胞排列密集,呈团块或/和条索分布,肿瘤新生血管数目多,细胞异型性明显。与模型组相比,随着鳖甲煎丸浓度增加,肿瘤细胞体积开始减小,新生血管开始逐渐减少,细胞坏死逐渐加重,细胞排列逐渐稀疏,细胞核逐渐变小,颜色逐渐变浅,肿瘤细胞异型性开始逐渐降低。索拉非尼组肿瘤细胞出现大面积坏死,组织内血管数量明显减少,肿瘤细胞异型性最低。2.使用双荧光素酶报告基因实验分别验证LncSNHG5/miR-26a-5p,miR-26a-5p/Wnt通路关键蛋白的互作关系,结果显示:（1）生物信息学预测结果显示,LncSNHG5与miR-26a-5p存在互作关系,miR-26a-5p与GSK-3β存在互作关系;（2）实验结果显示:在Hep G2细胞中,miR-26a-5p mimic+SNHG5-WT（野生型）共转染的荧光素酶活性值比mimic NC+SNHG5-WT共转染的活性显著降低（P＜0.05）,说明LncSNHG5野生型载体能够与miR-26a-5p相结合降低荧光素酶活性。同时,m i R-2 6 a-5 p m i m i c+G S K-3β-W T共转染的荧光素酶活性值比m i m i c NC+GSK-3β-WT共转染的活性显著降低（P＜0.05）,说明GSK-3β野生型载体能够与miR-26a-5p相结合降低荧光素酶活性。3.研究鳖甲煎用通过LncSNHG5/miR-26a-5p/Wnt信号通路对裸鼠肝癌模型的影响,结果显示:（1）在Lnc RNA信号通路上,与模型组相比,中药组LncSNHG5的表达量均降低,miR-26a-5p的表达量均升高,GSK-3β的表达量均下降（P＜0.05）;（2）在Wnt信号通路上,与模型组相比,中药干预组的关键蛋白β-catenin、GSK-3β表达量均有所下降（P＜0.05）。结论:1.鳖甲煎丸能抑制人肝癌hepG2裸鼠移植瘤的进展,有延缓肝癌细胞增殖,迁徙的能力;2.LncSNHG5通过抑制下游miR-26a-5P的表达,进而影响GSK-3β的表达,最终影响Wnt信号通路;3.鳖甲煎丸通过LncSNHG5/miR-26a-5p/GSK-3β/Wnt/β-catenin信号通路发挥抗癌作用机理。