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背景:炎症反应在多种肝脏疾病中作为二次打击可以进一步加重肝脏损伤,加速了病情恶化。解热镇痛药对乙酰氨基酚（N-acetyl-p-aminophenol,Acetaminophen,APAP）用药不当会导致严重的药物性肝损伤,会伴随肝脏炎症的发生,从而进一步加重肝脏损伤,严重者导致肝衰竭甚至死亡。非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis,NASH）中伴随的炎症反应会加速NASH进一步发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。因此,找到介导肝脏炎性反应的重要信号分子,并在此基础上发现活性药物,对于抑制肝脏的炎性损伤具有重要意义。目的:本论文在实验室前期研究基础上,采用体内外实验,主要从抑制热休克蛋白60（Heat shock protein 60,HSP60）介导炎性肝损伤的角度,揭示绿原酸（Chlorogenic acid,CGA）缓解APAP诱导药物性肝损伤以及蛋氨酸胆碱缺乏饲料（Methionine-Choline-Deficient Diet,MCD）诱导NASH的药效作用及其机制。通过研究为CGA在炎性肝损伤治疗中的潜在应用提供一定的科学依据。方法:1.采用APAP（300 mg/kg）给药小鼠6 h及APAP（200 mg/kg）给药小鼠24 h诱导肝损伤,并灌胃给药CGA进行治疗。检测血清中谷丙转氨酶（Alanine transaminase,ALT）和谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）活力,结合肝脏苏木精＆伊红（Hematoxylin-eosin,H＆E）染色结果,评价CGA抑制APAP诱导肝损伤的药效。检测肝脏炎性因子m RNA表达和髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）活力,结合F4/80免疫组化染色,评价CGA抑制APAP诱导的炎性肝损伤。采用Western-blot检测血清中HSP60、高迁移率族蛋白B1（High mobility group box-1,HMGB1）和葡萄糖调节蛋白94（Glucose regulated protein 94,Grp94）的含量。检测肝组织中腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine triphosphate,ATP）、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mt DNA）的含量。采用荧光实时定量聚合酶链反应（Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR）和Western-blot检测肝组织中HMGB1、HSP60、Lon蛋白酶（Lon protease,Lon）以及调控线粒体再生相关分子的m RNA和蛋白表达。2.将RAW264.7细胞与CGA（20,50μM）共同孵育15 min后,再加入HMGB1重组蛋白（2.5μg/m L）刺激24 h或再加入HSP60重组蛋白（100 ng/m L）刺激48h,采用Real-time PCR实验检测细胞内炎性因子m RNA表达。3.小鼠尾静脉注射HSP60中和抗体或免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,Ig G）对照抗体,10 min后再灌胃给药APAP（300 mg/kg）,评价HSP60中和抗体抑制APAP诱导炎性肝损伤的作用。4.野生型和Nrf2敲除（Nrf2 knockout,Nrf2 KO）型小鼠在APAP（300 mg/kg）给药后1 h,再灌胃给药CGA（40 mg/kg）,评价Nrf2 KO对CGA抑制APAP炎性肝损伤的影响。5.采用MCD喂养小鼠诱导形成NASH,灌胃给药CGA（30,60 mg/kg）及阳性药吡格列酮（10 mg/kg）进行治疗。检测血清中ALT/AST活力,进行肝组织H＆E染色观察以及NAFLD活动性评分（NAFLD activity score,NAS）,进行肝组织油红O染色观察,检测肝组织中非酯化脂肪酸（Non-esterified fatty acid,NEFA）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和ROS的含量,评价CGA改善NASH的药效。检测肝组织中MPO活力,炎性因子的m RNA水平以及环氧化酶2（Cyclooxygenase-2,COX2）、诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,i NOS）的蛋白表达,结合F4/80免疫组化染色实验,评价CGA抑制NASH病变中的炎性肝损伤。同时,检测肝组织中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3）炎性小体的激活。结果:1.在APAP（300 mg/kg）给药6 h及APAP（200 mg/kg）给药24 h诱导的小鼠肝损伤中,CGA降低血清中升高的ALT、AST水平,减少肝脏出血,改善APAP诱导的肝损伤。CGA降低APAP给药导致肝组织中升高的MPO活力以及炎性因子如白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNFα）、COX2、i NOS的m RNA表达,并减少APAP给药小鼠导致肝组织中F4/80染色巨噬细胞浸润的增多。CGA降低APAP给药小鼠导致血清中升高的HMGB1、HSP60含量和肝组织升高的HSP60 m RNA水平,并进一步提高HSP60蛋白在线粒体中的表达,但是对肝组织HMGB1的m RNA水平及其在胞核中蛋白表达均无明显影响。CGA对Lon的m RNA表达无明显影响,但能够抑制APAP降低肝脏线粒体中Lon蛋白的表达。CGA升高了APAP给药小鼠所导致的肝组织中减少的ATP及mt DNA含量,并降低升高的ROS水平。CGA虽然对APAP给药小鼠导致肝组织中降低的线粒体再生相关分子如过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α（Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α,PGC1-α）、核呼吸因子1（Nuclear respiratory factor 1,NRF1）、线粒体转录因子A（Mitochondrial transcription factor A,TFAM）、动力蛋白相关蛋白1（Dynamin-related protein 1,Drp1）的m RNA表达无明显影响,但是可以上调肝组织中下降的NRF1和TFAM蛋白表达,并减少升高的Drp1蛋白表达。2.CGA（25,50μM）能明显降低HMGB1或HSP60刺激RAW264.7细胞所导致细胞内炎性因子m RNA表达的升高。3.HSP60中和抗体能够降低APAP诱导小鼠血清中升高的ALT、AST活力及肝细胞坏死;还能够减少肝组织中F4/80染色巨噬细胞的浸润,并降低升高的MPO活力以及炎性因子COX2、TNFα的m RNA表达,说明HSP60中和抗体可以改善APAP诱导的炎性肝损伤。4.Nrf2 KO动物实验结果显示,在Nrf2 KO小鼠中CGA抑制APAP诱导肝损伤以及肝脏炎性反应的作用都明显减弱;CGA减少APAP诱导升高的血清中HSP60和HMGB1含量的作用也明显减弱;CGA增加肝组织线粒体中HSP60和Lon蛋白表达的作用消失了;但是Nrf2 KO对CGA上调肝组织中mt DNA的含量则没有明显的影响。5.在MCD诱导的小鼠NASH病变中,CGA能够降低血清中升高的ALT、AST活力,减轻肝脏脂质堆积,肝小叶炎症及肝细胞气球样变,降低升高的NAS评分。CGA还能降低MCD饲料喂养小鼠肝组织中升高的MPO活力、炎性因子IL-1β、COX2、TNFα、i NOS的m RNA表达以及COX2、i NOS的蛋白表达,并降低肝组织中升高的ROS及MDA水平。CGA也能减少MCD诱导NASH小鼠血清中升高的HSP60含量,上调肝组织中下降的HSP60 m RNA表达,并增加降低的肝脏线粒体中HSP60蛋白表达。CGA降低了MCD诱导NASH小鼠肝组织中升高的NLRP3、细胞凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1（Cysteine-dependent aspartate-directed protease 1,Caspase1）、IL-1β以及IL-1β前体的蛋白表达,并上调了降低的Caspase1前体Pro-caspase1的蛋白表达。结论:1.CGA通过抑制肝脏氧应激和炎性反应缓解了APAP诱导的肝毒性。CGA抑制APAP诱导炎性肝损伤的机制是通过诱导Nrf2激活,缓解APAP引起的线粒体损伤,提高线粒体中Lon及HSP60的蛋白表达,减少HSP60释放,抑制HSP60介导的肝脏炎性损伤;同时CGA还可以抑制HMGB1介导的肝脏炎性损伤。2.CGA通过抑制肝脏氧应激和炎性反应、降低肝脏脂质堆积缓解了MCD诱导的NASH病变。CGA能够改善MCD饲料诱导小鼠NASH病变中炎性肝损伤的机理可能是通过缓解肝脏氧应激损伤,减少线粒体HSP60的释放,抑制了HSP60介导的炎性肝损伤;同时CGA还能抑制肝脏NLRP3炎性小体的激活,从而进一步改善了炎性肝损伤。