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目的:缺血性中风是导致全球成人死亡和残疾的主要原因。为减少脑缺血造成的损伤,原则上应尽早治疗。大多数的患者因错过了治疗时间的黄金期从而导致脑缺血损伤,少数患者虽得到及时治疗,但由于治疗后血流的再通,大脑又产生继发性损伤,即脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤。线粒体质量控制与脑缺血损伤和脑I/R损伤密切相关。因此,研究线粒体质量控制亦或为脑缺血损伤及脑I/R损伤的治疗提供新的思路。研究发现,δ-阿片受体（delta-opioid receptors,DOR）在电针（electroacupu nture,EA）抗缺血性中风中具有重要作用,但是否与线粒体质量控制相关,相关研究甚少。本实验拟采用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞氧糖剥夺/再灌注模型（oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）,小鼠经颅电凝法制备永久脑缺血模型（permanent middle cerebral artery occlusion by transcranial ele ctrocoagulation,pMCAOE）和大鼠线栓法制备脑 I/R 模型（middle cerebral arter y occlusion/reperfusion,MCAO/R）,在体内外模拟脑缺血和脑I/R损伤过程,并且结合体外 siRNA（small interfering RNA）/体内 shRNA（short hairpin RNA）技术,深入研究DOR在电针治疗脑I/R损伤中的具体作用。方法:体外实验:[1]根据课题组前期探索,利用PC12细胞OGD/R（即氧糖剥夺6h/再灌注24h）体外模拟脑I/R损伤。分组如下:Control组、OGD/R组、OGD/R+Tan67组（tan67 dihydrobromide,Tan67）、OGD/R+NTI 组（naltrindole hydrochloride,NT I）、OGD/R+NTI+Tan67 组。SOD（super oxide dismutse）试剂盒检测各组细胞的SOD活性变化;MDA（malondialdehyde）试剂盒检测各组细胞的MDA含量变化;RT-qPCR 检测线粒体质量控制的 Drp1、Opa1、Fis1、Mfn1、PGC-1α、TF AM、Nrf1、PINK、Parkin 的 mRNA 表达情况。[2]构建靶向沉默大鼠DOR基因的siRNA,体外瞬时转染PC12细胞,RT-q PCR和Western Blotting法检测不同转染时间（24h和48h）,摸索适宜转染条件。后续探索95%N2、5%CO2缺氧小室诱导的OGD/R的时间（氧糖剥夺6 h、10h/复氧24h）对PC-12细胞的I/R损伤,CCK8法分析转染后PC12细胞的OGD/R的存活率,筛选出适当的OGD/R时间,利用转染后PC12细胞OGD/R（即氧糖剥夺10h/再灌注24h）用于后续实验。将PC12细胞分为以下六组:NC组（siRNA-NC 转染组）、NC+OGD/R 组（siRNA-NC 转染+OGD/R 组）、NC+O GD/R+Tan67 组（siRNA-NC 转染+OGD/R 组+DOR 激动剂）、siRNA-509 组（siRN A-509 转染组）、siRNA-509+OGD/R 组（siRNA-509 转染+OGD/R 组）、siRNA-509+OGD/R+Tan67 组（siRNA-509 转染+OGD/R+DOR 激动剂组）,CCK-8 试剂盒检测PC12细胞的存活率。RT-qPCR和Western Blotting技术检测各组细胞DOR的mRNA和蛋白表达情况。RT-qPCR检测各组细胞线粒体质量控制PGC-1α、T FAM、Nrf2、Pink、Parkin 的 mRNA 表达情况。体内实验:[1]C57小鼠侧脑室注射 AAV-509（adeno-associated virus,AAV）靶向沉默 D OR基因后,经颅电凝法制备pMCAOE模型模拟脑缺血损伤。C57小鼠随机分为八组:Sham组（假手术组）,NC组（阴性对照组）,NC+pMCAOE组（阴性对照模型组）,NC+pMCAOE+EA组（阴性对照治疗组）,AAV-509组（转染组）,AAV-509+pMCAOE 组（转染模型组）,AAV-509+pMCAOE+SEA 组（转染模型假EA治疗组）,AAV-509+pMCAOE+EA组（转染模型EA治疗组）。记录手术前后体重变化情况,神经功能评分检测各组小鼠的神经功能损伤情况,CV染色检测各组小鼠脑梗死体积。[2]SD大鼠侧脑室 AAV-509（adeno-associated virus,AAV）靶向沉默 DOR基因后,SD大鼠线栓法制备MCAO/R模型模拟脑I/R损伤。SD大鼠随机分为八组:Sham组（假手术组）,NC组（阴性对照组）,NC+MCAO/R组（阴性对照模型组）,NC+MCAO/R+EA组（阴性对照治疗组）,AAV-509组（转染组）,AAV-509+MCAO/R组（转染模型组）,AAV-509+MCAO/R+SEA组（转染模型假EA治疗组）,AAV-509+MCAO/R+EA组（转染模型EA治疗组）。记录手术前后体重变化情况,神经功能评分检测各组大鼠的神经功能损伤情况,CV染色检测各组大鼠脑梗死体积。结果:体外实验结果:[1]δ-阿片受体对PC12细胞OGD/R的实验结果:DOR激动剂Tan67预处理可明显增加OGD/R后SOD活性（P＜0.05）而该作用可被DOR抑制剂NTI阻断;DOR激动剂Tan67预处理可明显减少OGD/R后MDA含量（P＜0.01）而该作用也可被DOR抑制剂NTI阻断。DOR激动剂Tan67可明显增加PC-12细胞OGD/R 后 PGC-1α、PINK、Parkin 的 mRNA 表达（P＜0.05,P＜0.001,P＜0.05）,抑制剂NTI预处理则可阻断这一作用。以上结果提示DOR可能通过增加抗氧化酶SOD活性和减少过氧化物MDA含量来减少氧化应激,从而增加线粒体生物合成PGC-1α和线粒体自噬相关因子表达来调节线粒体质量控制平衡。[2]siRNA靶向沉默DOR对PC12细胞的OGD/R实验结果:siRNA-NC-FA M可成功转染PC-12细胞,转染效率达70%以上。前期设计的两条DOR-siRNA序列,结果显示在siRNA-509转染PC-12细胞24 h后mRNA抑制率可达50%以上和蛋白的抑制率可达60%以上。CCK-8检测细胞存活率,随着OGD/R时间的延长,细胞存活率也随之降低,在OGD/R（10h/24h）情况下存活率约为50%（P＜0.001）,选取该时间用于后续实验。siRNA-NC转染的PC12细胞在OG D/R 后,PGC-1α、TFAM 和 Nrf2 的 mRNA 表达明显减少（P＜0.01,P＜0.001,P＜0.001）,PINK、Parkin 的 mRNA 表达明显减少（P＜0.01,P＜0.001,）;DOR激动剂Tan67可以增加PC12细胞损伤后线粒体生物合成TFAM和Nrf2的mRN A表达（P＜0.01,P＜0.01）,增加线粒体自噬PINK和Parkin的mRNA表达（P＜0.05,P＜0.001）。siRNA-509转染的PC12细胞OGD/后的线粒体生物合成PGC-1α和线粒体自噬PINK、Parkin的mRNA表达明显降低（P＜0.01,P＜0.001,P＜0.001）,与 siRNA-509+OGD/R 相比,siRNA-509+OGD/R+Tan67 组的线粒体生物合成PGC-1α和线粒体自噬PINK、Parkin的mRNA在OGD/R诱导后并未发生明显改变。以上结果提示DOR可以通过增加线粒体生物合成PGC-1α和线粒体自噬PINK/Parkin从而调节线粒体质量控制平衡。体内实验结果:[1]小鼠pMCAOE脑缺血模型结果:小鼠模型未有死亡,小鼠手术前后24h体重改变,与NC+pMCAOE组相比,NC+pMCAOE+EA组体重明显减少（P＜0.05）;与 AAV-509+pMCAOE 组相比,AAV-509+pMCAOE+SEA 和 AAV-509+pM CAOE+EA组体重明显减少（P＜0.05）。与NC+pMCAOE组相比,EA可改善C57小鼠脑缺血后神经功能（P＜0.05）,与AAV-509+pMCAOE组相比,AAV-509+p MCAOE+SEA和AAV-509+MCAO+EA组神经功能损伤没有变化（P＞0.05）。CV染色结果显示,EA可减小C57小鼠脑缺血后的梗死体积（P＜0.05）,且AAV靶向沉默DOR可翻转EA的脑缺血保护作用。[2]大鼠MCAO/R脑I/R模型结果:大鼠模型死亡率15.6%,大鼠各组前后24h体重改变无明显差异（P＞0.05）。与NC+MCAO/R组相比,EA可改善SD大鼠脑 I/R 后神经功能（P＜0.05）,与 AAV-509 组相比,AAV-509+MCAO/R+SE A和AAV-509+MCAO/R+EA组没有变化（P＞0.05）。CV染色结果显示,EA可减小SD大鼠I/R后脑梗死体积（P＜0.05）,且AAV靶向沉默DOR可翻转EA的脑I/R保护作用。结论:[1]激活DOR对于OGD/R诱导的PC12细胞损伤有明显保护作用,DOR的神经保护作用可能是通过抑制OGD/R后氧化应激,增加线粒体生物合成PGC-1α和线粒体自噬PINK/Parkin实现。[2]siRNA-509靶向转染PC-12细胞24 h后可有效沉默DOR基因、抑制DOR蛋白的表达。激活DOR对于OGD/R诱导的PC 12细胞损伤有明显保护作用,DOR可能通过线粒体生物合成PGC-1α/TFAM/Nrf2和线粒体自噬PINK/Parkin发挥抗I/R损伤的神经保护作用,siRNA靶向沉默DOR逆转了这种保护作用。[3]EA“人中（GV26）”、“内关（PC6）”可减少小鼠脑缺血及大鼠脑I/R损伤后脑梗死体积,改善神经功能,具有明显的神经保护作用,AAV靶向沉默DO R翻转EA的脑缺血及脑I/R保护作用。提示EA通过DOR发挥对脑缺血和脑I/R的保护作用。[4]结合本次体内、外实验结果,我们认为电针的抗脑缺血和脑I/R作用可能与DOR调节线粒体质量控制相关。