【摘 要】
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目的:皮肤鳞状细胞癌是一种常见的皮肤肿瘤,环状RNA是一类特殊的非编码RNA。目前,已证实环状RNA在多种疾病进程中发挥重要作用,其在皮肤鳞状细胞癌中也有所研究。本研究拟选择高通量测序筛选出的在皮肤鳞状细胞癌中具有明显表达差异的一种环状RNA分子hsa＿circ＿0005435为研究对象,探究其在皮肤鳞状细胞癌中的表达及其过表达后对皮肤鳞状细胞癌细胞功能学的影响,预测其下游通路,并对预测结果进行初
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目的:皮肤鳞状细胞癌是一种常见的皮肤肿瘤,环状RNA是一类特殊的非编码RNA。目前,已证实环状RNA在多种疾病进程中发挥重要作用,其在皮肤鳞状细胞癌中也有所研究。本研究拟选择高通量测序筛选出的在皮肤鳞状细胞癌中具有明显表达差异的一种环状RNA分子hsa＿circ＿0005435为研究对象,探究其在皮肤鳞状细胞癌中的表达及其过表达后对皮肤鳞状细胞癌细胞功能学的影响,预测其下游通路,并对预测结果进行初步验证。研究方法:在Ha Ca T细胞系和皮肤鳞状细胞癌细胞系中,进行实时定量PCR检测hsa＿circ＿0005435在三种不同细胞中的表达量,通过Sanger测序对其进行环化位点检查。选择表达量差异更显著的A431细胞系进行慢病毒转染实验,通过转染预实验,确定正式转染所需要的MOI值和感染增强液,以及进行稳转株筛选时所需要的puromycin适宜浓度。以此条件进行正式转染实验,构建A431过表达稳转株。利用荧光显微镜对转染效率进行初步评估,同时对经过嘌呤霉素分选,荧光显微镜下转染合格的过表达稳转株进行实时定量PCR检测其中hsa＿circ＿0005435的表达量,以此判断转染是否成功。将慢病毒转染后过表达hsa＿circ＿0005435的A431稳转株为实验组,未转染hsa＿circ＿0005435的A431细胞为对照组,分别用CCK-8实验、流式细胞术、Transwell实验检测hsa＿circ＿0005435过表达后对A431细胞功能学产生的影响。预测hsa＿circ＿0005435下游的mi RNA和靶基因,并对预测结果进行ce RNA网络可视化。将circ Bank数据库与circinteractome数据库预测出的mi RNA结果进行取交集得到hsa-mi R-1299,hsa-mi R-524-3p,hsa-mi R-525-3p。选择其中网站预测结合可能性评分最高的hsa-mi R-524-3p进行后续研究。对hsa-mi R-524-3p预测出的靶基因进行GO功能富集和KEGG通路富集。将四个在线数据库网站预测出的hsa-mi R-524-3p下游靶基因结果取交集,得到的交集靶基因为RANBP10。对预测出的circ RNA-mi RNA-m RNA轴通过实时定量PCR检测当A431细胞过表达hsa＿circ＿0005435时,hsa-mi R-524-3p,RANBP10表达量是否会随之变化,根据结果判断circ RNA-mi RNA-m RNA轴是否存在。结果:1、通过实时定量PCR实验对高通量测序筛选出的hsa＿circ＿0005435在不同细胞中表达量进行检测,得到与测序一致的结果:hsa＿circ＿0005435在皮肤鳞状细胞癌细胞系中表达量显著下调（A431组:P＜0.001,SCL-1组:P＜0.001）,并检测了其环化位点位置。2、选择hsa＿circ＿0005435表达差异更显著的A431细胞系进行慢病毒转染实验。将荧光显微镜下符合转染要求的细胞,进行实时定量PCR检测转染效率。过表达稳转株中hsa＿circ＿0005435表达量显著高于未转染的A431细胞（过表达稳转株组:P＜0.001）,稳转株构建成功。CCK-8实验结果显示,当A431过表达hsa＿circ＿0005435后在450nm处吸光度更低,对A431细胞的增殖产生抑制作用（day1:P＜0.001,day2:P＜0.001,day3:P＜0.001）。流式实验结果显示,当hsa＿circ＿0005435过表达时,凋亡的细胞比例明显升高,对A431细胞凋亡产生了一定的促进作用。（P＜0.001）。Transwell实验结果显示,hsa＿circ＿0005435过表达后,发生迁移和侵袭的细胞数量都下降,对A431细胞的迁移和侵袭能力产生抑制作用（迁移实验:P＜0.001,侵袭实验:P＜0.001）。3、通过生物信息学分析,预测出的ce RNA调控轴为hsa＿circ＿0005435/hsa-mi R-524-3p/RANBP10,实时定量PCR结果显示,当A431细胞过表达hsa＿circ＿0005435后,A431细胞中内源性hsa-mi R-524-3p的水平明显降低（P＜0.001）,同时间接使RANBP10的水平有所升高（P＜0.001）。结论:1、两种皮肤鳞状细胞癌细胞系中hsa＿circ＿0005435的表达量比Ha Ca T细胞系中显著降低,与测序结果一致。2、证实了A431细胞过表达hsa＿circ＿0005435后可抑制其增殖、迁移和侵袭并促进凋亡。3、hsa＿circ＿0005435过表达后能通过下调hsa-mi R-524-3p的表达,间接升高了RANBP10的表达量,进而抑制了皮肤鳞状细胞癌的发生、发展。
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