【摘 要】
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家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）是呼肠孤病毒科（Reoviridae）质型多角体病毒属（Cypovirus）的代表成员。BmCPV病毒粒子为具有单层衣壳的二十面体形态,外部由多角体结构保护,多角体内可包含数个至数万个病毒粒子。目前已知BmCPV基因组由10段大小不等的dsRNA组成,由大到小分别为S1-S10,其
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家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）是呼肠孤病毒科（Reoviridae）质型多角体病毒属（Cypovirus）的代表成员。BmCPV病毒粒子为具有单层衣壳的二十面体形态,外部由多角体结构保护,多角体内可包含数个至数万个病毒粒子。目前已知BmCPV基因组由10段大小不等的dsRNA组成,由大到小分别为S1-S10,其中,S1-S4、S6和S7分别编码结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、VP6 和 VP7,S5、S8、S9 和 S10 分别编码非结构蛋白 NSP5、NSP8、NSP9和多角体蛋白Polh。研究病毒编码蛋白的结构功能及其之间的相互作用是病毒研究中不可或缺的部分,这将有助于理解病毒的组装,进而为病毒及其组分的开发利用提供新的思路。本研究首先通过酵母双杂交体系证明了 BmCPVVP7与Polh相互作用。尔后,分别构建表达VP7和Polh的昆虫细胞表达质粒pIZT-V5/His-S7、pIZT-S10。将两种质粒同时转染细胞,免疫荧光结果显示VP7与Polh在BmN细胞胞质中共定位。进一步,将DsRed N端的168个氨基酸序列与Myc标签融合,余下的C端氨基酸序列与HA标签融合,分别克隆进昆虫表达载体pIZT-V5/His构建pIZT-Myc-DsRedN168及 pIZT-HA-DsRed△N168,进一步将 VP7 和 Polh 基因分别克隆进上述两个质粒构建VP7/Polh与截短DsRed融合的表达质粒,转染细胞后荧光观察结果显示VP7与Polh在细胞内相互靠近致使DsRed两段彼此靠近发出红色荧光。随后为了明确Polh与VP7相互作用的关键区段,我们对VP7及Polh的二级结构进行了预测,根据预测结果设计了一系列二者的截短蛋白,并利用酵母双杂交实验将与Polh相互作用的VP7关键区域锁定在VP7 N端第331-360位氨基酸（VP7-N331-360）,而当Polh截短后在酵母系统内丧失与VP7的相互作用。VP7-N331-360结构分析显示其主体为一个α螺旋。酵母双杂交结果显示,当VP7第342位组氨酸突变为甘氨酸破坏该螺旋结构时VP7丧失与Polh的相互作用。质型多角体在自然环境下对其内部包埋的病毒粒子具有良好保护作用,是开发蛋白药物载体的良好选择。为确定VP7可以利用其与Polh的相互作用引导外源蛋白进入多角体,本研究将EGFP基因和bFGF基因分别融合在VP7-N331-360序列的5’端,尔后克隆进含有Polh基因表达盒的pFastBac TMDual载体的P10启动子下游,构建同时表达Polh和融合VP7-N331-360的EGFP/bFGF的载体,进一步,通过 Bac-to-Bac 系 统获得重组病毒 BmNPV-EGFP-VP7-Polh、BmNPV-bFGF-VP7-Polh。Western blotting 检测结果表明融合了 VP7-N331-360 的EGFP和bFGF成功被多角体包埋,多角体对EGFP包埋效率为6%,而对bFGF的包埋效率为51%。SDS-PAGE检测了不同储存条件下多角体对包埋的重组蛋白的保护作用,发现当多角体不经裂解储存于室温或-20℃时,包埋在多角体内部的重组蛋白无明显降解,而当多角体裂解后储存于室温2周,其内部包埋的蛋白基本降解完全,证实多角体对外源蛋白具有良好保护作用。Transwell实验发现包埋bFGF的多角体在不接触L-929细胞的情况下仍可促进细胞的迁移,推测在细胞培养条件下包埋在多角体的bFGF能释放进培养液。综上,VP7的N331-360区域是与Polh互作的关键区域,VP7-N331-360可引导与其融合的外源蛋白包裹进多角体,并保护包裹的蛋白免于降解。研究结果为理解病毒粒子包埋进多角体的机制提供了新的线索,为多角体包埋蛋白/药物微晶的开发提供了新方法。
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