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边界病是一种在羊群中广泛存在的病毒性疾病,该病以表现多种繁殖障碍性症状,如母羊不孕、流产、产死胎以及新生羔羊“长毛摇摆病”等而受到人们的关注,边界病病毒(border disease virus, BDV)为边界病的重要病原体。该病1959年爆发于英格兰和威尔士边界地区,之后在英国、美国、加拿大、西班牙、荷兰、瑞典、日本等国迅速传播开来,给世界养羊业造成巨大经济损失。我国之前没有关于边界病流行的研究报道,直至2013年才首次从持续性腹泻山羊中分离鉴定出BDV,证实边界病在我国的存在,开启了我国边界病研究的开端。随后对江苏省部分地区羊场展开边界病感染监测,初步筛选出一只疑似BDV感染绵羊。本研究针对此疑似病例,进行了病毒的分离鉴定以及检测方法的研究,具体研究内容如下：1.绵羊边界病病毒的分离鉴定与基因组序列分析通过对疑似血清样品进行瘟病毒RT-PCR筛检,利用MDBK细胞分离培养,并结合电镜观察和BDV特异性Npro基因RT-PCR技术,鉴定分离病原。随后采用RT-PCR方法分段扩增分离毒株全基因组序列,通过基因组序列比对和5’-UTR、 Npro基因系统进化分析,确定分离毒株分类地位以及与外国BDV分离株的亲缘关系,并通过人工感染试验,观察试验羊发病情况,以衡量该毒株的致病能力。结果显示,从疑似BDV感染绵羊血清中分离鉴定出一株ncp型BDV,命名为JSLS 12-01。基因组测序获得分离毒株基因组全长为12227bp(Genbank登录号：KC963426),两端5’-UTR和3’-UTR大小分别为278bp和255bp。基因组核苷酸和氨基酸序列比对显示该分离株与已有BDV参考毒株核苷酸同源性为72.3%-80.4%,氨基酸同源性在80.1%-89.7%之间。5’-UTR和Npro基因序列系统进化分析显示,JSLS12-01毒株与德国源毒株Gifhorn、中国山羊源分离株AH12-01和AH12-02亲缘关系最近,属于BDV 3亚型。临床监测中,被检绵羊血清病毒核酸检测持续阳性,抗体始终为阴性,为持续性感染病例；同龄羊对比观察可见该羊体型瘦小,生长速度明显缓慢。人工感染试验中,实验组未见明显发病,仅在感染后1-7d出现病毒血症,随后血清中和抗体滴度开始升高。研究结果表明,JSLS 12-01毒株基因组序列和5’-UTR, Npro基因与国外BDV毒株具有较大差异性,提示国内BDV毒株可能具有独特的进化模式和方向。2. BDV E2蛋白间接EL ISA检测方法的建立比对分析E2基因片段的抗原性、疏水性,设计扩增E2基因的特异性引物,RT-PCR扩增后,将目的片段克隆到pET-32α、构建重组质粒pET-32α-E2,并转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,借助SDS-PAGE电泳分析和western-blot鉴定重组蛋白的表达情况与免疫活性。将已纯化的重组蛋白作为包被抗原,构建间接ELISA检测方法,经反应条件的优化,确定最优反应条件。利用间接ELISA方法和商品化BDV抗体试剂盒、western-blot分析对187份血清样品进行检测,比较结果的敏感性和特异性,并应用该ELISA方法对批量临床血清样品进行检测。SDS-PAGE电泳分析和western-blot鉴定结果显示,本研究成功表达了E2重组蛋白且具有良好的免疫原性。通过反应条件的优化,最终确定间接ELISA方法的最佳抗原包被浓度为4ug/mL,20g/L BSA进行封闭,血清1：50倍稀释后作用1h,兔抗山羊IgG-HRP1:30000稀释作用45min,最后TMB显色10min。与商品化BDV抗体检测试剂盒和western-blot检测相比,所建立ELISA检测方法敏感性和特异性分别为76.25%、73.83%和61.54%、87.10%。应用建立的ELISA方法对江苏省部分羊场307份血清样品进行BDV抗体检测,结果显示总阳性率为41.37%。结果表明：诱导表达的E2重组蛋白具有良好的抗原性,将其作为包被抗原,建立的间接ELISA检测方法特异性较好,变异性也较小。与商品化BDV抗体检测试剂盒和western-blot相比,有较高的符合率。关于国内山羊和绵羊BDV感染的相继报道,以及临床血清样品检测表明,在国内小反刍动物中边界病流行较为普遍,且在个别地区羊场中BDV感染率较高,提示要增强广大畜主对边界病认识,把握流行趋势,探索有效的防治措施,降低BDV对国内羊群的危害。