【摘 要】
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奶牛乳腺炎是一种发病率极高的疾病,给牧场造成巨大的经济损失。奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）是奶牛乳腺发挥功能的主要细胞,也是病原体入侵奶牛乳腺组织的第一道屏障,在乳腺固有免疫中起着重要的功能。MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码小RNA,已被证明可在转录后水平调控基因表达并参与多种生物学过程。前期的研究表明miR-199a-3p能够调控小鼠和人的多种细胞功能。然而,miR-199a-3p
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（No.32172709）； 宁夏重点研发项目（引才专项）（No.2019BEB04002）；
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奶牛乳腺炎是一种发病率极高的疾病,给牧场造成巨大的经济损失。奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）是奶牛乳腺发挥功能的主要细胞,也是病原体入侵奶牛乳腺组织的第一道屏障,在乳腺固有免疫中起着重要的功能。MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码小RNA,已被证明可在转录后水平调控基因表达并参与多种生物学过程。前期的研究表明miR-199a-3p能够调控小鼠和人的多种细胞功能。然而,miR-199a-3p在bMECs炎症反应中的分子作用还未被探索。为深入研究miR-199a-3p在奶牛乳腺炎中的功能,本研究拟从分子和细胞水平研究miR-199a-3p在bMECs炎症反应过程中的表达模式及其分子调控作用,并探索miR-199a-3p对bMECs炎症反应中的细胞增殖与凋亡的影响。主要研究结果如下:（1）采用RNA-seq技术检测了过表达miR-199a-3p组和对照组bMECs中的转录组,并进行了差异表达mRNA的筛选及功能注释。结果表明,与对照组相比,过表达miR-199a-3p组有140个差异表达的mRNA（其中上调mRNA 109个,下调mRNA31个）;KEGG及GO分析结果表明,上述差异mRNA可能通过调控PI3K-Akt信号通路、TGF-β信号通路和IL-17信号通路而参与机体免疫和炎症反应调控过程。这些结果提示miR-199a-3p可能通过影响相关mRNA表达,并通过上述信号通路而调控奶牛乳腺炎。（2）利用生物信息学方法和文献资料预测出SP1、MTOR、PTPRF、CD2AP、BCAR3、NET1和CNOT7为miR-199a-3p的潜在靶基因。本研究构建了上述7个潜在靶基因mRNA 3’UTR双荧光素酶报告基因重组载体,并通过双荧光素酶报告基因实验鉴定了 miR-199a-3p与上述潜在靶基因调控关系。结果表明,CD2AP为miR-199a-3p的靶基因;miR-199a-3p与其他的6个mRNA不存在靶向调控关系。（3）采用qRT-PCR技术检测了 miR-199a-3p在LPS诱导bMECs产生炎症反应中的表达水平,结果表明,与0h相比,miR-199a-3p在LPS诱导炎症反应的3、6、12和24h的表达量均上调,其中6h和12h极显著上调（P＜0.01）,6h上调最多,提示miR-199a-3p可能在bMECs炎症反应中具有调节作用。（4）建立了超表达及抑制miR-199a-3p的炎症性bMECs模型,并检测了靶基因CD2AP及PI3K/AKT/NF-KB信号通路关键基因及蛋白表达、炎症因子基因表达及分泌,以及细胞增殖及凋亡情况。结果表明,超表达miR-199a-3p能显著抑制靶基因CD2AP的mRNA及蛋白、信号通路关键基因（PIK3CA、PIK3R1、AKT1T、AK3、IKBKB、RELA和TLR4）及蛋白（PI3K、AKT 和p-p65）、炎症因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）及凋亡基因（CASP3和CASP9）的mRNA表达。同时,抑制炎症因子分泌,促进bMECs的增殖并抑制其凋亡。抑制miR-199a-3p后,获得了与超表达miR-199a-3p相反的实验结果。这些结果提示miR-199a-3p抑制了 bMECs的炎症反应及细胞凋亡。综上所述,miR-199a-3p通过靶向CD2AP基因并调节PI3K/AKT/NF-KB信号通路,抑制了LPS诱导的bMECs炎症反应及细胞凋亡。研究结果为乳腺炎分子治疗提供了一个潜在的靶点,也为抗乳腺炎奶牛分子育种奠定基础。
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