翼状胬肉是睑裂部球结膜及其下纤维血管组织呈三角形增生并侵犯角膜的一种疾病，是临床上常见和多发的眼科疾病之一。翼状胬肉的研究历史虽然已有两千多年，但是迄今为止，其发病机制和复发原因仍然没有被人类所认知，对翼状胬肉的研究仍然是眼科研究热点之一。病理学证实胬肉组织中有大量纤维组织和新生血管，属于增生性疾病，可推测新生血管在胬肉发生发展中起重要作用。研究证实微循环系统的微血管内皮细胞在形态和功能上不同于作为通道血管的大血管内皮细胞，研究发生在某器官组织的血管病变最好是研究该组织的微血管内皮细胞。目前国内外尚没有关于翼状胬肉微血管方面的研究。本研究旨在探索建立体外分离和培养翼状胬肉细胞的方法，并进一步探讨细胞之间的相互作用及其可能机制以及紫外线对细胞的作用，为进一步研究新生血管在翼状胬肉发病机制的作用研究打下基础。 主要研究内容包括：一、翼状胬肉细胞的体外分离和培养(一)研究目的在体外分离和培养翼状胬肉细胞，建立研究翼状胬肉发病机制的细胞模型。 (二)研究方法将50例临床手术切除的翼状胬肉标本无菌剪成1×1×1mm3组织块，采用组织块双酶(胰蛋白酶和胶原酶)消化法消化30mins，血清终止消化后，200目金属筛过滤后收集滤液，离心收集沉积物，用1640培养液和内皮细胞培养液(DMEM+SFM)分别制成悬液，接种于培养瓶中。细胞生长出来后，经细胞鉴定(形态学、免疫组织化学和电镜)和纯化(选择性培养基法、机械刮除法及密度梯度离心法)后，可得到翼状胬肉成纤维细胞和微血管内皮细胞。 (三)研究结果1、形态学观察结果翼状胬肉组织块接种后，镜下36-48h有梭形细胞从组织块爬出，3-4d形成细胞团，5-6d形成漩涡状生长，从形态上初步认定为成纤维样细胞，该细胞为长梭形，核位于中部，呈漩涡状生长，生长速度较快。48-72h有三角形或多边形细胞从组织块爬出，5-7d形成克隆样细胞团，逐渐向周围生长，10-14d形成单层细胞，初步认定为内皮细胞样细胞，该细胞呈三角形或多边形单层生长，生长速度较慢。50例样本均有成纤维细胞，37例培养出内皮细胞样细胞。 2、免疫组化和电镜鉴定结果采用SABC免疫组化法检测获得的细胞。成纤维细胞VIM表达阳性，表现为胞浆呈棕褐色，细沙粒状着色。微血管内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原和CD34分子表达阳性，表现胞浆呈棕褐色，细沙粒状着色；CD31分子表达阴性。 透射电镜观察，微血管内皮细胞胞浆中见大量粗面内质网，线粒体等细胞器，并可见内皮细胞特征结构W-P小体。 3、细胞纯化结果纯化前，成纤维细胞及微血管内皮细胞混杂在一起；经过分离和纯化后，可将成纤维细胞和微血管内皮细胞分开，得到成纤维细胞和微血管内皮细胞。 (四)研究结论翼状胬肉标本通过双酶消化法在体外可以分离和培养，并经鉴定和纯化后得到翼状胬肉微血管内皮细胞和成纤维细胞，方法简便，可操作性强，为研究翼状胬肉的发病机制提供细胞模型。 二、细胞之间的相互作用(一)、研究目的探讨翼状胬肉中微血管内皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用，以及它们在翼状胬肉发病机制中的角色。 (二)、研究方法收集临床翼状胬肉标本，采用翼状胬肉微血管内皮细胞和成纤维细胞单独培养、条件培养和共同培养的方法形成不同培养体系，通过ELISA和RT-PCR等方法检测三种培养体系中两种细胞培养上清液和细胞中VEGF和bFGF的蛋白和RNA含量变化。 (三)、研究结果1、从细胞上清液中VEGF和bFGF的含量表达来看，微血管内皮细胞单独培养，条件培养和共同培养三个体系相比，细胞因子的表达呈现明显升高的趋势(P＜0.05)；成纤维细胞单独培养，条件培养和共同培养三者相比，细胞因子的表达同样呈现升高的趋势(P＜0.05)； 2、细胞上清液中的细胞因子在分泌后，随时间变化有明显的线性降解。VEGF的降解过程，PEC明显快于PF；bFGF的降解过程，PEC和PF趋势相近； 3、从细胞中VEGF和bFGF的RNA含量表达来看，微血管内皮细胞单独培养，条件培养和共同培养三个体系相比，RNA的表达明显升高(P＜0.01)；成纤维细胞单独培养，条件培养和共同培养三个体系相比，bFGF的表达同样呈现升高的趋势(P＜0.05)； (四)、研究结论1、微血管内皮细胞中VEGF和bFGF的RNA表达和细胞上清液中VEGF和bFGF的蛋白表达水平有共同趋势：共同培养＞条件培养＞单独培养； 2、成纤维细胞中VEGF和bFGF的RNA表达和细胞上清液中VEGF和bFGF的蛋白表达水平有共同趋势：共同培养＞条件培养＞单独培养； 3、微血管内皮细胞和成纤维细胞有相互上调作用，两种细胞在翼状胬肉的发生发展过程中相互促进。 三、细胞因子及其受体的改变(一)、研究目的检测并探讨细胞因子及其受体的变化及其可能机制。 (二)、研究方法收集临床原发翼状胬肉标本20例和正常结膜10例，每一例标本对称切成两份。一份制成石蜡和冰冻切片，采用免疫组织化学技术检测VEGF和bFGF两种细胞因子及其相应受体VEGFR2和FGFR1在翼状胬肉和结膜中的表达；另一份(1)组织匀浆离心后提取上清液采用ELISA和Westernblot技术检测VEGF和bFGF两种细胞因子含量改变，(2)提取RNA后采用RT-PCR技术检测VEGFR2和FGFR1的RNA在翼状胬肉和结膜中的改变； (三)、研究结果1、免疫组织化学结果显示VEGF主要表达在血管内皮细胞及其周围，而bFGF主要表达在成纤维细胞及其周围；VEGFR2和FGFR1主要表达在血管内皮细胞胞膜上，在成纤维细胞胞膜上也有少量表达； 2、ELISA和Westernblot结果表明VEGF含量在翼状胬肉中明显要强于结膜，而bFGF的表达在胬肉和结膜中没有差异； 3、RT-PCR结果证实VEGFR2表达在翼状胬肉中明显高于结膜，而FGFR1表达结膜高于翼状胬肉。 (四)、研究结论1、翼状胬肉组织中VEGF的表达高于结膜；而bFGF表达在两种组织中没有差异； 2、VEGFR2的表达翼状胬肉明显高于结膜，而FGFR1的表达则是结膜高于翼状胬肉，提示翼状胬肉中血管生产通过VEGF诱导途径。 四、紫外线对细胞的作用(一)、研究目的通过研究紫外线对翼状胬肉细胞模型的作用，探讨紫外线和翼状胬肉发生发展之间的关系； (二)、研究方法收集临床翼状胬肉标本，采用翼状胬肉微血管内皮细胞和成纤维细胞单独培养、条件培养和共同培养的方法形成不同培养体系，1用MTT方法选择紫外线照射细胞的适宜强度，2采用MTT法绘制在强度为20mJ/cm2的紫外线照射下两种细胞生长曲线的改变，3通过ELISA和RT-PCR等方法检测在强度为20mJ/cm的紫外线照射下三种培养体系中两种细胞培养上清液和细胞中VEGF和bFGF的蛋白和RNA含量变化。 (三)、研究结果1、通过不同强度紫外线照射细胞活性的实验，PEC和PF两种细胞都在20mJ/cm2的照射强度下细胞活性保持较好，故选择20mJ/cm2的照射强度作为实验中照射基数； 2、PEC和PF两种细胞在紫外线(20mJ/cm2)照射下，细胞活性都下降，生长速度下降，进入对数生长期时间延迟； 3、PEC受紫外线照射后VEGF的RNA含量和上清液VEGF蛋白含量在单独培养体系中，照射组较未照射组有明显下降，差异有显著性意义(P＜0.05)；PF受紫外线照射后VEGF的RNA含量和上清液VEGF含量在单独培养体系和条件培养体系中，照射组较未照射组有明显下降，差异有显著性意义(P＜0.05)， 4、PEC和PF两种细胞受紫外线照射后bFGF的RNA含量以及细胞上清液中bFGF的蛋白含量改变有共同趋势：单独培养体系、条件培养体系和共同培养体系中照射组较未照射组呈明显下降改变，差异均有显著性意义(P＜0.05)； (四)、研究结论紫外线对体外培养的翼状胬肉微血管内皮细胞和成纤维细胞有抑制作用，表现在细胞活性下降，呈剂量依赖性，生长速度减缓，细胞周期阻滞；细胞因子VEGF和bFGF的RNA和蛋白质水平普遍下调。