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背景及目的:胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤,在全球发病率及死亡率都呈逐年上升趋势,同时也是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管近年来胰腺癌的诊断和治疗有所改善,但患者预后仍然很差,总5年生存率小于10%。胰腺癌预后不良的主要原因是肿瘤无症状进展、分子异质性和早期播散。因此,更好地了解胰腺癌发生、发展过程中的机制,将为胰腺癌的治疗提供新方向,并为改善患者预后起到积极作用。Hippo信号通路是一条进化上高度保守的抑制性细胞信号通路,该通路激活的关键是通过激酶级联反应促进转录激活因子YAP（Yes相关蛋白）/TAZ（转录调节蛋白1）磷酸化,进而限制细胞增殖和组织生长。Hippo通路的关键调节因子是LATS1（Large tumor suppressor 1）和LATS2（Large tumor suppressor 2）激酶,LATS1/2可以在多个不同位点直接磷酸化YAP和TAZ,抑制其进入细胞核,在核外与14-3-3蛋白相互作用并通过泛素蛋白酶体途径进行降解。而未被磷酸化的YAP和TAZ则可以进入细胞核,并与DNA结合蛋白发生相互作用,触发细胞增殖、凋亡和迁移等基因的转录。泛素蛋白酶体系统在人类多种肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用。FBXO22（F-box only protein 22）蛋白是一种E3泛素连接酶,已被报道参与肿瘤进展的多个方面。多个基因数据库数据显示,FBXO22在胰腺癌中存在高表达。然而,FBXO22蛋白在胰腺癌中的临床意义和生物学功能仍不清楚,本课题通过深入研究FBXO22在胰腺癌中的表达情况,分析其临床意义,并探讨FBXO22在胰腺癌发生、发展中的作用及其机制,对胰腺癌的早期诊断及精准治疗有一定临床意义。方法:1、通过数据库GEPIA分析FBXO22在胰腺癌组织中的表达情况,同时采用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）、实时荧光定量PCR（q RT-PCR）及蛋白质印迹法（Western blotting,WB）检测FBXO22在胰腺癌及对应癌旁组织中的表达情况。统计分析FBXO22不同表达水平与胰腺癌术后患者临床病理特征及生存时间的关系。2、通过干扰及转染技术建立低表达和高表达FBXO22的胰腺癌细胞株。使用CCK-8、克隆形成实验在体外检测各组细胞增殖能力。通过构建裸鼠移植瘤模型,在体内研究FBXO22表达对胰腺肿瘤生长的影响。3、在FBXO22不同表达水平的细胞系、胰腺癌及对应癌旁组织中,通过q RT-PCR检测FBXO22、LATS2及Hippo通路相关基因CYR61、CTGF、C-Myc m RNA的表达;WB检测FBXO22、LATS2、YAP1、p-YAP1蛋白的表达;免疫荧光检测胰腺癌细胞中YAP1定位情况。4、采用蛋白免疫共沉淀（Co-IP）检测胰腺癌细胞中FBXO22与LATS2之间能否直接相互作用。在抑制胰腺癌细胞蛋白合成及降解的前提下,通过WB检测FBXO22不同表达水平对LATS2蛋白表达的影响。泛素化实验检测过表达或低表达FBXO22对LATS2泛素化水平的影响。5、设计回复性实验:在高表达FBXO22的胰腺癌细胞中敲低FBXO22,同时下调LATS2的表达,通过CCK8和细胞克隆形成实验观察肿瘤细胞增殖能力的变化;裸鼠成瘤实验观察肿瘤的生长情况。结果:1、FBXO22在胰腺癌组织中高表达。GEPIA数据库显示FBXO22 m RNA在胰腺癌组织中表达显著高于癌旁组织。q RT-PCR、WB检测结果显示FBXO22m RNA及蛋白水平在胰腺癌组织中明显高于癌旁组织。IHC数据显示FBXO22阳性染色主要出现在胰腺癌组织样本中,而癌旁组织为弱染色或阴性染色。2、FBXO22高表达组患者预后更差。IHC结果统计分析:FBXO22高表达与胰腺肿瘤大小和淋巴结转移显著相关;但是与患者性别、年龄、TNM分级、血管及神经浸润无明显相关性。FBXO22高表达组患者总生存期更差和无病生存期更短。3、FBXO22促进胰腺癌细胞增殖及肿瘤生长。CCK-8、细胞克隆形成和裸鼠成瘤实验显示:敲低FBXO22表达后抑制了胰腺癌细胞增殖及肿瘤生长;而过表达FBXO22则促进胰腺癌细胞增殖及肿瘤生长。4、FBXO22通过LATS2抑制Hippo信号通路。q RT-PCR显示:在胰腺癌细胞中FBXO22过表达促进了CYR61、CTGF、C-myc的m RNA表达,而对LATS2m RNA水平没有明显影响。WB显示:FBXO22过表达显著降低p-YAP1和LATS2蛋白表达;但增加了总YAP1蛋白。在胰腺癌组织中LATS2蛋白明显低表达,且与FBXO22蛋白水平呈负相关。免疫荧光显示:FBXO22过表达后细胞浆中YAP1表达减少,而细胞核内YAP1表达增加。5、FBXO22直接结合LATS2,并促进LATS2的泛素化和降解。Co-IP显示:胰腺癌细胞中FBXO22蛋白可以和LATS2蛋白直接结合。CHX抑制蛋白质合成后,观察到FBXO22沉默显著抑制胰腺癌细胞中的LATS2蛋白降解。在用MG132阻断蛋白酶体途径后,高表达FBXO22的胰腺癌细胞中LATS2蛋白无明显变化,即FBXO22对LATS2的作用在胰腺癌细胞中被消除。泛素化实验显示:在下调FBXO22表达后降低了胰腺癌细胞中LATS2的泛素化,而上调FBXO22表达则增加了LATS2的泛素化。6、敲低LATS2能部分逆转FBXO22介导的致癌作用。CCK-8、细胞克隆形成、裸鼠成瘤实验显示:FBXO22敲低后显著抑制胰腺癌细胞增殖及肿瘤生长;而伴随LATS2的敲减,胰腺癌细胞增殖及肿瘤生长较对照组明显改善,即下调FBXO22促进胰腺肿瘤生长的作用部分得到逆转。结论:1、FBXO22在胰腺癌组织中高表达,且与胰腺癌患者临床病理特征及预后密切相关;2、FBXO22在体内外均能促进胰腺癌细胞增殖和肿瘤生长;3、FBXO22通过LATS2抑制Hippo通路活性并影响下游靶基因;4、FBXO22能与LATS2直接结合,并对LATS2进行泛素化修饰后,通过泛素-蛋白酶体系统进行降解;5、FBXO22通过泛素化降解LATS2抑制Hippo信号通路,从而促进胰腺癌细胞增殖及肿瘤生长。