【摘 要】
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猪链球菌溶血毒素（Suilysin,SLY）是猪链球菌（Streptococcus suis,SS）重要的毒力因子,通过在细胞膜上形成孔道来裂解宿主细胞。靶向抑制SLY的毒力能够显著降低猪链球菌的致病性。SLY由四个结构域（D1-D4）构成,其中SLYD4是SLY与细胞膜结合的关键结构域。而SLYD4对猪链球菌溶血毒素SLY的免疫保护研究还鲜有报道。本研究旨在制备并鉴定重组猪链球菌溶血毒素SLY（
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猪链球菌溶血毒素（Suilysin,SLY）是猪链球菌（Streptococcus suis,SS）重要的毒力因子,通过在细胞膜上形成孔道来裂解宿主细胞。靶向抑制SLY的毒力能够显著降低猪链球菌的致病性。SLY由四个结构域（D1-D4）构成,其中SLYD4是SLY与细胞膜结合的关键结构域。而SLYD4对猪链球菌溶血毒素SLY的免疫保护研究还鲜有报道。本研究旨在制备并鉴定重组猪链球菌溶血毒素SLY（r SLY）及其重组SLYD4蛋白（r SLYD4）,探究r SLYD4对r SLY的免疫保护效果,为未来通过抗SLY毒力因子防治猪链球菌的后续研究提供数据支持和理论参考。一、制备并鉴定了可溶性表达的r SLY并攻毒小鼠进行其毒力验证。首先成功制备并鉴定了可溶性的r SLY（55 k Da）。将sly基因片段连入p Cold I载体,成功构建了p Cold I-sly重组质粒。然后将p Cold I-sly转入大肠杆菌BL21感受态,以5%IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE与Western blotting鉴定,成功制备出55 k Da的可溶性r SLY,并证明了其对小鼠红细胞具有溶血活性。其次是将制备的r SLY腹腔攻毒C57BL/6小鼠进行其毒力验证。使用SPSS27.0软件用Bliss法计算出r SLY对C57BL/6小鼠半数致死量为1.645μg/g（1.349～2.055μg/g）,腹腔攻毒C57BL/6小鼠会致其肺,肝,肾,肠等器官出现显著病变,且r SLY对各病变组织的侵袭显著。二、制备并鉴定了r SLYD4并证实了其对r SLY攻毒小鼠有较好的免疫保护效果。首先成功制备并鉴定了可溶性的r SLYD4（18 k Da）。将slyd4基因片段连入p ET-28a载体,构建了p ET-28a-slyd4重组质粒。将p ET-28a-slyd4转入大肠杆菌BL21感受态,以5%IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE与Western blotting鉴定,成功制备出18 k Da的可溶性r SLYD4,并证明了其对小鼠红细胞不具有溶血活性。其次证实了r SLYD4对r SLY攻毒小鼠具有较好的免疫保护效果。用r SLYD4三次免疫小鼠后,小鼠产生的抗体效价为1:512000;脾淋巴细胞增殖试验发现r SLYD4引起细胞的增殖率为27.23%;对r SLYD4免疫后小鼠进行r SLY攻毒,存活率为65%,说明r SLYD4免疫小鼠后,能有效刺激小鼠产生免疫反应,并提高小鼠存活率;组织病理学及免疫组织化学分析结果显示,r SLYD4免疫组存活的小鼠肺脏,肾脏,肠道病变都显著减轻,且r SLY对各组织的侵袭显著减少。证明r SLYD4免疫对r SLY攻毒小鼠具有较好保护效果。
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