【摘 要】
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目的:研究不同浓度的钩吻素子（Koumine,Kou）、Kou联合顺铂对人肝癌细胞株（Hep G2、7404、7402）增殖活性的影响,以及ROS、JNK1、Akt、Bcl-2、Bax等相关基因表达水平的变化,探讨Kou联合顺铂是否存在协同增效作用以及不同浓度的Kou对肝癌细胞株增殖的影响及其可能的分子作用机制,为临床上Kou联合顺铂应用于肝癌治疗的可行性提供实验依据。方法:1、体外实验培养三种肝
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目的:研究不同浓度的钩吻素子（Koumine,Kou）、Kou联合顺铂对人肝癌细胞株（Hep G2、7404、7402）增殖活性的影响,以及ROS、JNK1、Akt、Bcl-2、Bax等相关基因表达水平的变化,探讨Kou联合顺铂是否存在协同增效作用以及不同浓度的Kou对肝癌细胞株增殖的影响及其可能的分子作用机制,为临床上Kou联合顺铂应用于肝癌治疗的可行性提供实验依据。方法:1、体外实验培养三种肝癌细胞株（Hep G2、7404、7402）;2、采用MTT法检测不同浓度Kou组、顺铂组、Kou联合顺铂组对肝癌细胞（Hep G2、7404、7402）增殖的影响,并计算各药物的IC50值;利用荧光DCFH-DA探针法测定细胞内ROS含量水平;细胞集落形成实验分析药物对肝癌细胞集落生长的影响;实时定量PCR检测ROS相关基因（Akt、JNK1、Bcl-2和Bax m RNA）的转录水平;蛋白印迹法检测评价Akt、JNK1/2、Bcl-2和Bax蛋白表达水平;3、统计学处理,使用SPSS21.0软件分析实验结果的数据,运用t检验方法分析,计量资料使用均数±标准差（`x±s）来表示,计数资料采用卡方检验,以P＜0.05为具有统计学差异,P＜0.01为具有统计学显著差异。结果:（1）Kou处理3种肝癌细胞株（Hep G2、7404、7402）后肿瘤细胞增殖均明显受抑制,呈现剂量依赖效应,其IC50值分别为90.32μg/m L、107.96μg/m L、89.59μg/m L。Kou在较低浓度（10μg/m L）下即可发挥抑制作用,与Kou低浓度（≦10μg/m L）比较,Kou在浓度20μg/m L时具有较强的活化作用;Kou联合顺铂组对3种肝癌细胞均有明显的抑制作用,其抑制作用要比Kou组、顺铂组的抑制作用更强,呈浓度依赖性;（2）活性氧含量检测实验显示Kou20μg/m L组中肝癌细胞内的ROS水平较对照组的有所下降,随着Kou浓度增加,细胞内的ROS水平升高,Kou联合顺铂组肝癌细胞内的ROS水平较Kou组、顺铂组的高;（3）细胞集落形成实验显示在Kou20μg/m L组别中,3种肝癌细胞的集落形成能力均较对照组的有所增加,随着Kou浓度增加,细胞集落形成能力明显受抑制,Kou联合顺铂组对肝癌细胞的集落形成能力抑制更明显;（4）RT-PCR结果显示使用不同浓度Kou（分别为20.0、120、200μg/m L）处理三种肝癌细胞（7402、7404和Hep G2细胞）48h后,与对照组比较,Kou浓度20μg/m L组的JNK1、Bax均有所下降（仅为对照组的0.8～0.9倍）,Kou浓度120μg/m L组和Kou浓度200μg/m L组JNK1、Bax均有所增高;与对照组比较,Kou浓度20μg/m L组的Bcl-2增高为1.32～1.94倍,Akt增高为1.37～1.76倍,而Kou120μg/m L组和Kou200μg/m L组中Bcl-2呈浓度依赖性下降（分别为0.47～0.55倍和0.09～0.13倍）（P＜0.01）。Akt在三组肝癌细胞中的变化与Bcl-2类似。（5）蛋白印迹实验结果显示钩吻素子与顺铂联用组Akt水平较Kou组或顺铂组均有所下降,而JNK水平则显著升高,同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达,上调促凋亡蛋白Bax蛋白表达,提高Bax/Bcl-2。结论:1、Kou联合顺铂能有效抑制人肝癌细胞株（Hep G2、7404、7402）的增殖,具有协同增效作用;2、Kou浓度20μg/m L时具有较强的活化作用,考虑存在Hormesis效应;3、Kou联合顺铂对肝癌细胞株的抑制作用可能与其作用于JNK/Bcl-2/Bax信号通路有关。
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