【摘 要】
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研究背景和目的:中医是经验医学,中医治疗糖尿病有大量的有效经验记载,探究中医治疗糖尿病的治疗用药经验,发现治疗消渴病的常用药、常用方剂、用药性味归经规律,可用以指导临床治疗糖尿病用药、也可为糖尿病药物的基础研究提供可选择的方向。在目前现代医学中寻找通过增加胰岛β细胞的数量改善胰岛功能的有效方法,是近年来的糖尿病治疗研究的热点,人参是中医治疗消渴古籍中出现频率较高的药物之一,其是否具有增加胰岛β细胞
【基金项目】
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上海市优势病种（zybz-2017021）； 上海市科委（18401903400、19401934200）； 浦东科委（PKJ2017-Y10）；
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研究背景和目的:中医是经验医学,中医治疗糖尿病有大量的有效经验记载,探究中医治疗糖尿病的治疗用药经验,发现治疗消渴病的常用药、常用方剂、用药性味归经规律,可用以指导临床治疗糖尿病用药、也可为糖尿病药物的基础研究提供可选择的方向。在目前现代医学中寻找通过增加胰岛β细胞的数量改善胰岛功能的有效方法,是近年来的糖尿病治疗研究的热点,人参是中医治疗消渴古籍中出现频率较高的药物之一,其是否具有增加胰岛β细胞数量尚不明确。本研究将明确人参的主要活性成分人参皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1,GRg1）是否具有促进胰岛β细胞有增殖和新生的作用及相关机制。材料与方法:1、用“消渴”为关键词,通过中医智库（古籍）数据库检索相关的古籍记录,将检索的相关资料分别按照书名、作者、朝代,方剂、药名、四性、五味、归经等为项目要素,用Excel进行数据库建立。对数据采用频数、频率分析,聚类分析的统计方法进行消渴病治疗用药规律分析。2、使用胰岛β细胞系INS-1细胞作为研究对象,通过CCK-8进行药物浓度与细胞活性、细胞增殖的筛选。用EDU掺入的方法检测细胞增殖情况。通过RT-q PCR、Western blot方法检测胰岛β细胞增殖相关周期蛋白的表达变化及PI3K/Akt信号通路活性。通过PI3K抑制剂（LY294002）阻断PI3K/Akt信号通路作用后,再次检测GRg1对INS-1的增殖的影响。3、用胰腺导管细胞系HPDE6细胞作为研究目标,通过慢病毒感染,构建基因组整合了Pdx1-promoter-cherry序列的HPDE6细胞模型。通过荧光表达观察GRg1作用后细胞红色荧光的表达情况,同时通过RT-q PCR检测胰岛β细胞分化相关基因的m RNA的表达情况。结果:1、通过关键词“消渴”在中医智库（古籍）数据库中检索出11本从北周至近现代的与消渴相关古籍医书,一共包含108首治疗消渴的相关有效经验方剂,共包含102味药物、548频次,人参为使用频率最高的中药,出现41次（7.84%）。将出现频次＞3的中药定义为高频使用中药,一共有42味高频中药。高频中药的“四性”以寒性频率最高（39.53%）,凉、热性药物较少。“五味”则以甘味为主（41.54%）苦、辛随后,其他药味使用较少。高频药物的“归经”主要是归脾（18.49%）、肺（17.65%）、胃（15.13%）、肾（12.61%）经。参考《中药学》可以将中药分为9类,其中清热生津药（24.3%）、补气药（22.8%）为频率最高的药类。2、CCK-8检测结果,与对照组相比GRg1处理组的吸光度在各浓度组均明显增加（P＜0.05）,其中0.1μM、0.01μM GRg1组增加程度最高。EDU细胞增殖检测结果显示与5.6m M葡萄糖（Glu）对照组（L组）相比,5.6 m M Glu+（0.1μM、0.01μM）GRg1组（L+RG组）的INS-1细胞增殖均显着增高,约比L组增加50%（P＜0.05）。实时定量PCR检测增殖相关的基因Ki67 m RNA的表达,与L组相比,L+RG组表达增加,略低于16.7 m M Glu对照组（H组）。WB检测也发现细胞周期相关基因Ccnd1 m RNA和蛋白表达明显升高。同时我们还发现GRg1可激活PI3K/Akt通路,GRg1处理后Akt磷酸化水平明显升高。而使用PI3K抑制剂（LY294002）抑制PI3K-Akt通路活化后,与L+RG组相比EDU掺入率明显下降约90%（P＜0.05）,Ki67 m RNA的表达降低,细胞周期相关Ccnd1的蛋白表达也明显下降。3、成功构建了包含Pdx1启动子的稳转HPDE6细胞株,0.1μM的GRg1作用72h后激活了稳转HPDE6细胞中的Pdx1启动子活性,RT-q PCR检测发现GRg1作用72h后INS、Pdx1、Ngn3基因m RNA表达升高而Sox9表达下降。结论:1、人参为消渴治疗使用频率最高的药物,清热生津补气为主要治疗方法,人参白虎汤为使用频率最高的方剂,药多甘寒、归肺脾胃肾经。2、GRg1可促进胰岛β细胞的增殖,说明GRg1在维持β细胞数量中起着重要的作用,需要我们进一步关注。GRg1促进胰岛β细胞的增殖可能是通过激活PI3K-Akt通路,调节细胞周期相关蛋白的表达而实现的。3、GRg1能通过上调导管细胞Pdx1、Ngn3表达促进导管细胞向IPCs细胞转化,但其详细机制还需进一步研究。
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